[发明专利]Otof 1273 (CT)基因定点突变的耳聋小鼠模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种Otof 1273 (CT)基因定点突变的耳聋小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1) 设计高效识别Otof基因的sgRNA序列；

(2) 体外转录Cas9 mRNA、sgRNA，体外合成Donor oligo；

(3) 配置包含Cas9 mRNA、sgRNA、Donor oligo的混合物；

(4) 将步骤(3)所述混合物注射到小鼠受精卵中，并将所述受精卵移植到代孕小鼠体内，进行妊娠，产出小鼠并进行基因型的鉴定，得到Otof 1273 (CT)基因定点突变的耳聋小鼠模型；

步骤(1)中所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤(2)中所述Donor oligo的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述混合物中的Cas9 mRNA的用量为125 ng；

步骤(3)中所述混合物中的sgRNA的用量为62.5 ng；

步骤(3)中所述混合物中的Donor oligo的用量为125 ng；

步骤(3)中所述混合物的体积为5 μL；

步骤(4)中所述受精卵来源于C57BL/6J小鼠；

步骤(4)中所述注射的方式为显微注射法；

步骤(4)中所述妊娠的时间为19-21天。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括受精卵供体小鼠超排卵；

所述受精卵供体小鼠超排卵包括如下步骤：

(1) 孕马血清促性腺激素处理供体雌性小鼠；

(2) 40-50 h后注射人绒毛膜促性腺激素，并与雄性小鼠进行交配，次日收集受精卵；

步骤(1)中所述小鼠为C57BL/6J小鼠。

4.一种CRISPR/Cas9系统在构建Otof 1273 (CT)基因定点突变的耳聋小鼠模型中的应用；

所述系统包含Cas9 mRNA、序列如SEQ ID NO.1所示的sgRNA、序列如SEQ ID NO.2所示的Donor oligo。

5.根据权利要求1所述的构建方法构建得到的Otof 1273 (CT)基因定点突变的耳聋小鼠模型在筛选用于预防和/或治疗耳聋的候选药物中的应用。