[发明专利]一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法

说明书

本发明属于G01N30/00技术领域，更具体的涉及一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法。一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，包括以下步骤：通过干血斑自动取卡器材将干血斑卡片从干血斑样本盘取出置于解吸部位，进入LC‑HRMS系统进行分离和检测，完成。经本发明提供的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法结合高效液相‑高分辨质谱技术，在缩短时间前处理时间的同时提高检测灵敏度，避免检测过程中因为手动操作带来的操作误差对检测准确度和灵敏度的影响。

技术领域

本发明属于G01N30/00技术领域，更具体的涉及一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法。

背景技术

干血斑采样技术，是一种将全血样品收集在干血斑卡片上的采样技术。与传统静脉采血相比，干血斑采样技术具有操作简便、取血量少、微创性，保存和运输的简易化，室温下样本的稳定性等优势。近年来，干血斑与色谱质谱技术的联用在兴奋剂检测领域引起了广泛的关注和研究。

据WADA统计，兴奋剂违规事件中近半数是合成类固醇类兴奋剂违规，在世界体育运动中，睾酮是类固醇类兴奋剂中常用的滥用物质。睾酮有多种形式和剂量，最广泛的使用形式是肌内注射睾酮酯。十一酸睾酮酯也可以口服给药。睾酮进入血液循环后吸收会减慢，从而产生长效作用。当口服或注射睾酮酯制剂后，该酯缓慢扩散到血流中，尽管酶解过程立即开始，但在血液中仍可检测到一定比例的睾酮酯原型（非专利文献1）。

虽然尿液长期以来是兴奋剂检测的主要基质之一，但在尿液中，睾酮酯则是以游离睾酮及其代谢物的形式存在，难以检测到睾酮酯原型。目前，对尿液样本中外部摄入的类固醇类兴奋剂检测的常规方法，存在检测灵敏度较低，分析通量小以及检测成本较高等问题。该类物质特有的化学结构使其质谱检测灵敏度较差，目前多采用衍生后进行气相色谱串联质谱（GC-MS/MS）的方法对尿液样本进行检测，内源性类固醇兴奋剂的外部摄入还需要同位素比质谱（IRMS）进行确证。但是，在血液样本中可直接检测外源性睾酮酯原型，一旦在血液样本中检测到睾酮酯的存在，即可确认其兴奋剂违规。非专利文献1中还通过血液样本检测睾酮酯可作为IRMS睾酮确证分析的补充。

现阶段，已有公开的非专利文献2公开了对干血斑样本中睾酮酯进行检测的研究，但是现阶段的研究多采用传统的干血斑样本前处理方法，该方法是离线手动进行的，步骤繁琐耗时且存在检测灵敏度较低等问题。干血斑样本分析的前处理方法可能是影响该技术发展和应用的主要因素之一。由于样本体积有限以及高度复杂的样本基质（包括溶血的血细胞以及高含量的可溶性和不溶性蛋白质等），这些都可能会影响对目标物的分析检测。为了进一步提升干血斑样本在类固醇酯物质中检测的准确性和灵敏度，并且提升检测效率，有必要建立一种高灵敏度、高通量的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法。

非专利文献如下：

【非专利文献1】药物检测与分析（Drug testing and analysis）；2015，7(11-12)：983-989；

【非专利文献2】药学与生物医学分析杂志（Journal of pharmaceutical andbiomedical analysis）；2014，96：21-30；

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，包括以下步骤：

（1）通过干血斑自动取卡器材将干血斑卡片从干血斑样本盘取出置于解吸部位；

（2）进行拍照确认干血斑准确位置；

（3）利用卡片夹固定步骤（1）中卡片上的干血斑，使解吸溶液流穿干血斑的限定区域以解吸分析物，内标溶液通过HPD泵随解吸溶液一起通过干血斑，结束后再次拍照确认提取完成；

（4）解吸溶液进入在线固相萃取系统中，进行目标物净化和富集；