[发明专利]一种重组SGLT2蛋白及其应用

权利要求书

1.一种重组SGLT2蛋白，其特征在于，所述重组SGLT2蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的重组SGLT2蛋白；

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由权利要求3所述的重组质粒转染受体细胞包装得到。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述的重组质粒；

优选地，所述重组细胞含有权利要求4所述的重组病毒。

6.一种权利要求1所述的重组SGLT2蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将核酸分子克隆入载体中，构建重组质粒；

所述重组质粒转染受体细胞，构建重组病毒；

所述重组病毒感染哺乳动物细胞，诱导蛋白表达，再进行纯化，得到所述重组SGLT2蛋白。

7.根据权利要求6所述的重组SGLT2蛋白的制备方法，其特征在于，所述载体包括pEGBacmam载体；

优选地，所述克隆后还包括转化克隆感受态细胞、鉴定阳性单克隆再进行重组的步骤；

优选地，所述克隆感受态细胞包括Trans5α；

优选地，所述重组的步骤包括所述阳性单克隆转化重组感受态细胞，蓝白斑筛选，得到重组质粒；

优选地，所述重组感受态细胞包括DH10 Bac；

优选地，所述受体细胞包括昆虫细胞sf9。

8.根据权利要求6或7所述的重组SGLT2蛋白的制备方法，其特征在于，所述感染的步骤包括：

哺乳动物细胞的密度为1～5×10⁶细胞/mL时，加入重组病毒，培养12～24h；

优选地，所述哺乳动物细胞包括HEK293S GnTI细胞；

优选地，所述诱导蛋白表达的步骤包括：

加入诱导剂，降温，继续培养；

优选地，所述诱导剂包括丁酸钠，所述丁酸钠的终浓度为8～12mM；

优选地，所述降温的温度为28～32℃；

优选地，所述继续培养的时间为48～60h；

优选地，所述纯化的步骤包括：

离心收集细胞，使用缓冲液重悬，破碎细胞后加入蛋白提取溶液，孵育，收集上清液，直链淀粉树脂纯化蛋白，再通过尺寸排阻层析柱分离目标蛋白，检测；

优选地，以质量分数计，所述缓冲液包括0.8％～1.2％不含EDTA的蛋白酶抑制剂，余量为45～55mM Tris-HCl和140～160mM NaCl组成的混合溶液，所述缓冲液的pH值为7～8；

优选地，以质量分数计，所述蛋白提取溶液包括0.8％～1.2％N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷和0.08％～0.12％胆固醇半琥珀酸酯，余量为水；

优选地，所述收集上清液通过离心进行，所述离心的转速为35000～50000rpm；

优选地，以质量分数计，所述直链淀粉树脂纯化使用的洗涤液包括0.08％～0.12％N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷和0.008％～0.012％胆固醇基半琥珀酸酯，余量为45～55mMTris-HCl和140～160mM NaCl组成的混合溶液，所述洗涤液的pH值为7～8；

优选地，以质量分数计，所述直链淀粉树脂纯化使用的洗脱液包括0.04％～0.08％糖苷元，余量为35～45mM麦芽糖、45～55mM Tris-HCl和140～160mM NaCl组成的混合溶液，所述洗脱液的pH值为7～8；

优选地，所述直链淀粉树脂纯化蛋白后还包括浓缩的步骤；

优选地，所述浓缩使用的浓缩器的截止分子量为不大于100kDa；

优选地，以质量分数计，所述尺寸排阻层析柱分离目标蛋白使用的分离液包括0.04％～0.08％糖苷元，余量为45～55mM Tris-HCl和140～160mM NaCl组成的混合溶液，所述洗脱液的pH值为7～8；

优选地，所述检测包括SDS-PAGE和/或Western Blot。