[发明专利]一种LC-MS/MS检测血浆烷基间苯二酚代谢产物水平的方法

说明书

本发明公开了一种LC‑MS/MS检测血浆烷基间苯二酚代谢产物水平的方法，所述代谢产物为3‑(3,5‑二羟基苯基)‑1‑丙酸(DHPPA)，属于生物标志物检测技术领域。样品采用蛋白沉淀法进行预处理，色谱分离采用BETASILPhenyl色谱柱(2.1×150mm,3μm)，以流动相0.1％乙酸水溶液和0.1％乙酸乙腈梯度洗脱；质谱采用电喷雾电离(ESI)和多反应监测模式(MRM)测定目标分析物。从专属性、标准曲线、线性范围和LLOQ、精密度和准确度、提取回收率和基质效应、稳定性试验等指标进行全面的方法学验证，结果均符合标准要求。本发明方法具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点，可实现对血浆DHPPA准确、快速的定量分析；而且样本预处理简便，可满足人群研究大规模样本分析需求。

技术领域

本发明属于生物标志物检测技术领域，具体涉及一种LC-MS/MS检测血浆烷基间苯二酚代谢产物水平的方法。

背景技术

烷基间苯二酚是一组酚类脂质，在小麦和黑麦的麦麸中含量丰富，而在精制小麦和黑麦以及其他常见谷物等中含量很低或没有。烷基间苯二酚在食物加工中具有热稳定性，约60％被人体吸收，其在人体内代谢途径与生育酚类似，主要在肝脏中通过细胞色素P450酶系统进行β氧化，产生的代谢产物3-(3,5-二羟基苯基)-1-丙酸(DHPPA)和3,5-二羟基苯甲酸(DHBA)能够在人血浆中被检测到。干预性和观察性研究均发现，机体烷基间苯二酚及其代谢产物的浓度显著受膳食全谷类小麦和黑麦摄入量的影响，并呈现出剂量-效应关系，能够反映全谷类食物摄入的中、长期暴露水平。因此，ARs及其代谢产物被提议作为全谷类食物摄入和谷物膳食纤维摄入的有效生物标志物，已被应用于流行病学研究中。药代动力学实验显示，血浆烷基间苯二酚的半衰期很短，约5h，而其代谢产物DHBA和DHPPA半衰期则要长很多，分别为10.1h和16.3h。考虑到流行病学研究中通常采集研究对象的空腹血液样本，且血浆DHPPA的生物半衰期较长(16.3h)，DHPPA作为全谷类食物摄入和谷物膳食纤维摄入的有效生物标志物具有更大的优势，更适合应用于营养流行病学研究。

全谷类食物摄入在健康促进与疾病预防方面越来越引起人们的关注。增加全谷类食物摄入可降低诸如糖尿病、心血管疾病、肥胖及某些癌症的发生风险。在营养流行病学研究中，通常采用膳食调查评估个体食物摄入量。鉴于膳食调查存在其固有缺陷，难以精确地评估个体全谷类食物摄入量，全谷类食物摄入生物标志物血浆DHPPA作为传统膳食调查方法的一种替代和补充，能够更为客观、精准地反映个体的全谷类食物摄入水平，在营养流行病学研究中显得意义重大。

现有测定血浆烷基间苯二酚代谢产物DHPPA浓度的方法，如高效液相色谱-库伦点击阵列法(HPLC-CEAD)与气相色谱串联质谱法(GC-MS)，上述方法均存在一定程度的局限性。HPLC-CEAD检测方法所需的样本量较大，定量下限只有15nmol/L，不仅浪费了宝贵的生物样本，而且无法满足全谷类食物摄入水平偏低的亚洲人群的生物样本检测需求。GC-MS检测方法同样有着明显的缺点，需要进行衍生化操作，样品预处理繁琐，仪器分析时间较长，不利于大规模样本的测试分析。因此，开发建立一种快速、灵敏、准确检测血浆烷基间苯二酚代谢产物的方法对于营养流行病学研究至关重要。

发明内容

本发明提供了一种LC-MS/MS检测血浆烷基间苯二酚代谢产物水平的方法，意在解决现有检测方法分析时间长、样品预处理繁琐的问题。

一种LC-MS/MS检测血浆烷基间苯二酚代谢产物水平的方法，先对血浆样品进行预处理，然后，用LC-MS/MS法测定预处理后血浆样品中烷基间苯二酚代谢产物的浓度。

LC-MS/MS法的色谱条件：色谱柱为BETASIL Phenyl分析柱，2.1×150mm，3μm；进样体积5μL；进出口柱温30℃；流动相由0.1％乙酸水溶液的A相和0.1％乙酸乙腈的B相组成；流速为0.4mL/min；梯度洗脱。