[发明专利]一种用于低宿主背景干扰的核酸文库制备方法及应用

说明书

本发明涉及动物、植物及微生物靶基因的扩增技术领域，具体涉及一种用于低宿主背景干扰的核酸文库制备方法及应用；可以改善核酸靶向测序分析技术，并可以提供准确的靶向测序、多重测序及高通量测序；可以用于对核酸的低拷贝靶基因进行测序，降低宿主高丰度核酸干扰；可用于核酸靶基因的靶向测序；可用于核酸靶基因的去除用于测序，提高检测准确性。

技术领域

本发明涉及动物、植物及微生物靶基因的扩增技术领域，尤其涉及一种用于低宿主背景干扰的核酸文库制备方法及应用。

背景技术

在目前涉及生物研究的技术中，从Sanger测序到以Illumina测序平台的二代测序技术和单分子测序为主的三代测序，核酸测序技术得到了广泛的应用。随着测序技术的不断发展，虽然不同的测序平台的测序准确性及精确性不断提高，但是对于复杂样本中混合有大量于靶基因同源的或非同源的核酸序列带来的污染难以消除这一难题仅从测序平台的更迭是无法消除的。这一问题在单一物种的测序中尚能通过算法优化等方法加以克服，但对于多物种混合测序(如宏基因组测序)则会带来无法避免的污染。

在目前对于复杂样本靶基因测序的方法中，多种试验实践使用了在核酸纯化、聚合酶链式反应及测序数据后期去除等策略进行了改进，但无可避免的会在核酸纯化试剂盒的使用中造成样本核酸提取的偏差、聚合酶链式反应中使用特殊引物造成部分核酸片段无法扩增或扩增结果与实际丰度偏离和靶基因被高丰度同源序列掩盖等缺点。这些缺点最终导致了与靶序列同源性较高的核酸序列无法完全去除，靶序列的序列信息及丰度无法全部真实的获，降低了检测的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于低宿主背景干扰的核酸文库制备方法及应用，用于核酸样品中高丰度非靶序列的去除，同时提高低拷贝靶向基因序列在测序过程中不会被高丰度非同源核酸序列干扰，可在任意测序平台获得真实可靠结果，提高检测准确性。

为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种用于低宿主背景干扰的核酸文库制备方法，包括：

设计靶序列探针引物，使用聚合酶获得核酸模板，进而获得探针；

探针通过与靶序列进行杂交形成DNA-RNA复合体；

使用非配对核酸内切酶和单链特异性核酸酶切断杂交体；

使用靶序列通用引物获得扩增子群体进行测序文库构建。。

在一实施方式中，所述靶序列探针引物为单一寡聚核苷酸、一系列寡聚核苷酸或修饰的寡聚核苷酸中的一种。

在一实施方式中，设计靶序列探针引物，使用聚合酶获得核酸模板，进而获得探针，具体包括：

使用扩增引物和核酸模板对靶向或非靶向序列进行扩增子扩增，产生一个或多个扩增子。

在一实施方式中，设计靶序列探针引物，使用聚合酶获得核酸模板，进而获得探针，具体还包括：

使用DNA模板用于产生靶向基因的扩增子生成探针，所述探针为DNA、RNA或DNA/RNA杂交探针。

在一实施方式中，探针通过与靶序列进行杂交形成DNA-RNA复合体，具体杂交方式为：

探针与靶标核酸通过退火方式杂交、探针与靶标核酸在缓冲液中进行杂交、探针与靶标核酸在紫外线处理下杂交、探针拴系于固体或半固体支持物上与核酸杂交、探针与拴系于固体或半固体支持物上的核酸杂交中的一种。

在一实施方式中，所述非配对核酸内切酶为T7核酸内切酶。

在一实施方式中，所述单链特异性核酸酶为S1核酸酶。

第二方面，本发明还提供一种用于低宿主背景干扰的核酸文库的应用，对核酸文库进行高通量测序。