[发明专利]一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用有效
| 申请号： | 202110903398.X | 申请日： | 2021-08-06 |
| 公开（公告）号： | CN113637703B | 公开（公告）日： | 2023-08-25 |
| 发明（设计）人： | 吴同垒;肖丽荣;史秋梅;张志强;周诗淼;冀梦瑶 | 申请（专利权）人： | 河北科技师范学院 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/66;A61K39/10;A61K39/385;A61P31/04 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 崔自京 |
| 地址： | 066000 河北省*** | 国省代码： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 布鲁氏菌 l7 l12 groes 表达 载体 构建 方法 及其 应用 | ||
1.一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）提取B.abortus 2308基因组DNA；
（2）利用引物LG-1和LG-2PCR扩增L7/L12基因，LG-3和LG-4PCR扩增GroES基因；扩增产物纯化后1：1混匀作为重叠PCR的模板，以引物LG1和LG4进行扩增，将L7/L12和GroES两个基因连接，获得L7/L12-GroES；
其中，LG-1和LG-2以及LG-3和LG-4的引物序列如下：
LG-1：5´-GCGGATCCACCATGGTGGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3´，SEQ ID NO.1；
LG-2：5´-GCGCTCGGGCAGTATCATCATTCCTCCCTTGAGTTCAACCT
TGGCGCCAGCA-3´，SEQ ID NO.2；
LG-3：5´-GGCGCCAAGGTTGAACTCAAGGGAGGAATGATGATACTG
CCCGAGCGCCT-3´，SEQ ID NO.3；
LG-4：5´-GCCTCGAGTCAGACAAGCGCATGTAGAGAAGCA-3´，SEQ ID NO.4；
（3）将纯化后的L7/L12-GroES与质粒pcDNA3.1进行双酶切、连接和转化，涂布Amp平板培养过夜；挑取单菌落进行PCR鉴定，获得阳性克隆，提取质粒，经测序验证正确，获得真核表达载体pcDNA3.1-LG。
2.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR和重叠PCR的反应体系为：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，PCRMixture 25μL，蒸馏水补齐50μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 60s，50℃ 30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃终末延伸8min。
3.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法构建的布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
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