[发明专利]一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明公开的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，利用OverlapPCR方法连接基因L7/L12和GroES，利用pcDNA3.1构建真核表达载体pcDNA3.1‑LG。真核表达载体pcDNA3.1‑LG用于制备布鲁氏菌疫苗。本发明通过构建L7/L12和GroES的融合表达真核载体，免疫小鼠后，机体产生了良好的体液和细胞免疫力，为布鲁氏菌核酸疫苗的开发奠定了重要基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，给牛羊养殖业造成了巨大经济损失，同时严重威胁人类健康。疫苗免疫是预防布鲁氏菌病较为有效的方法，商品化的布鲁氏菌疫苗有A19、S2、Rev1、M5和RB51等，均为弱毒疫苗，但是存在安全性不足的缺点，例如A19可导致怀孕动物流产，并存在排毒风险，且大都能够感染人并引起一过性疾病。DNA疫苗安全性高，且现有研究显示某些基因能够刺激机体产生较强的保护力，逐渐得到人们的重视。

基于布鲁氏菌L7/L12基因的DNA疫苗在能够产生良好的保护作用。GroES是热休克蛋白hsp60家族的辅助蛋白，可以激活宿主免疫反应，同时参与抗原呈递，增强宿主免疫应答水平。

因此，提供一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)提取B.abortus 2308基因组DNA；

(2)利用引物LG-1和LG-2 PCR扩增L7/L12基因，LG-3和LG-4 PCR扩增GroES基因；扩增产物纯化后1：1混匀作为重叠PCR的模板，以引物LG1和LG4进行扩增，将L7/L12和GroES两个基因连接，获得L7/L12-GroES；

其中，LG-1和LG-2以及LG-3和LG-4的引物序列如下：

LG-1：5’-GCGGATCCACCATGGTGGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3’；SEQ ID NO.1；

LG-2：5’-GCGCTCGGGCAGTATCATCATTCCTCCCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGCA-3’；SEQID NO.2；

LG-3：5’-GGCGCCAAGGTTGAACTCAAGGGAGGAATGATGATACTGCCCGAGCGCCT-3’；SEQ IDNO.3；

LG-4：5’-GCCTCGAGTCAGACAAGCGCATGTAGAGAAGCA-3’；SEQ ID NO.4；

(3)将纯化后的L7/L12-GroES与质粒pcDNA3.1进行双酶切、连接和转化，涂布Amp平板培养过夜；挑取单菌落进行PCR鉴定，获得阳性克隆，提取质粒，经测序验证正确，获得真核表达载体pcDNA3.1-LG。

进一步，步骤(2)所述PCR和重叠PCR的反应体系为：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，PCR Mixture 25μL，蒸馏水补齐50μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 60s，50℃30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃终末延伸8min。