[发明专利]一种判断种公猪精液质量的基因检测引物及判断方法

权利要求书

1.一种判断种公猪精液质量的基因检测引物，其特征在于，检测引物包括如下序列：

HSF1基因引物对，其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2；

VDAC2基因引物对，其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

WIP1基因引物对，其正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种判断种公猪精液质量的方法，其特征在于：以精子密度、顶体完整率、精子活力、精子DNA完整率、精子线粒体活性作为精液质量正向指标。

3.权利要求2所述的判断种公猪精液质量的方法，其特征在于：该方法以候选基因HSF1基因、候选基因VDAC2和候选基因WIP1基因作为精液质量标记基因。

4.权利要求3所述的判断种公猪精液质量的方法，其特征在于：根据候选基因HSF1基因表达水平判断精子密度和顶体完整率；候选基因HSF1基因分别与精子密度和顶体完整率呈正相关；候选基因HSF1基因表达水平越高，精子密度和顶体完整率越高，在其他指标相同条件下，公猪精液质量越高。

5.权利要求3所述判断种公猪精液质量方法，其特征在于：根据候选基因VDAC2基因表达水平判断精子活力；候选基因VDAC2基因与精子活力呈正相关；候选基因VDAC2基因表达水平越高精子活力越强，在其他指标相同条件下，公猪精液质量越高。

6.权利要求3所述判断种公猪精液质量方法，其特征在于：根据候选基因WIP1基因表达量判断精子活力和精子线粒体活性；候选基因WIP1基因分别与精子活力和精子线粒体活性呈负相关；候选基因WIP1基因表达水平越低，精子活力和精子线粒体活性越高，在其他指标相同条件下，公猪精液质量越高；所述公猪为霍寿黑猪。

7.权利要求3所述判断种公猪精液质量方法，其特征在于：根据候选基因WIP1基因表达量判断精子活力和精子DNA完整率；候选基因WIP1基因分别与精子活力和精子DNA完整率呈负相关；候选基因WIP1基因表达水平越低，精子活力和DNA完整率越高，在其他指标相同条件下，公猪精液质量越高；所述公猪为杜洛克猪和长白猪。

8.权利要求2或5所述的判断种公猪精液质量方法，其特征在于：所述种公猪为霍寿黑猪；所述正向指标为精子活力。

9.权利要求2-8任一项所述的判断种公猪精液质量方法，其特征在于，该方法具体步骤为：(1)以精子密度、顶体完整率、精子活力、精子DNA完整率、精子线粒体活性作为精液质量正向指标；(2)以候选基因HSF1基因、候选基因VDAC2和候选基因WIP1基因作为精液质量标记基因；(3)根据候选基因设计PCR引物，其中，HSF1基因引物对，其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2；VDAC2基因引物对，其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；WIP1基因引物对，其正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；(4)提取种公猪精液中精子总RNA；(5)mRNA逆转录获取cDNA；(6)利用步骤(3)所示的PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增；(7)对步骤(6)获得的PCR扩增产物进行基因表达水平比较；(8)候选基因HSF1基因、VDAC2基因水平越高，候选基因WIP1基因表达水平越低的种公猪精液质量越高。

10.一种种公猪精液质量候选基因的筛选方法，其特征在于，该方法具体步骤为：(1)精液质量指标选择：以精子活力、精子密度、精子活率、顶体完整率、精子质膜完整率、精子畸形率、精子DNA完整率、精子线粒体活性作为精液质量评价指标；(2)qRT-PCR引物设计：选择候选基因HSF1，设计其正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2；候选基因VDAC2，设计其正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示；候选基因WIP1，设计其正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向序列如SEQ ID NO.6所示；候选基因P34H，设计其正向序列如SEQ ID NO.7所示，反向序列如SEQ ID NO.8所示；内参引物GAPDH，设计其正向序列如SEQ ID NO.9所示，其反向序列如SEQ ID NO.10所示；(3)试验动物选择：选择饲养条件完全一致、年龄段一致、健康状态良好的杜洛克、霍寿黑猪、长白猪种公猪，采集精液；(4)精液质量评价：将步骤(3)各种公猪的精液按照步骤(1)的评价指标进行评价；(5)cDNA模板获得：将步骤(3)获得的精液进行精子总RNA提取，进行逆转录；反应程序为：42℃15min，42℃30min，85℃5min；(6)qRT-PCR扩增，反应程序为：94℃30s，94℃5s，61℃35s，荧光检测1次，共40个循环，每个样本设置为3个重复；(7)数据统计分析：采用SPSS 25.0软件单因素方差分析程序分析品种间精液品质相关指标的差异，用SPSS 25.0软件Pearson相关性程序分析精液质量参数指标和基因表达的相关性；(8)种公猪精液质量候选基因选择：根据步骤(7)统计结果发现，HSF-1基因的表达与霍寿黑猪精子密度、顶体完整率呈显著正相关；VDAC2基因的表达与霍寿黑猪、杜洛克猪的精子活力均呈显著正相关；WIP1基因的表达与杜洛克种公猪的精子活力、DNA完整率呈显著负相关；WIP1基因的表达与霍寿黑猪种公猪的精子活力、精子线粒体活性呈显著负相关；WIP1基因的表达与长白猪种公猪的精子活力、DNA完整率呈显著负相关；P34H基因的与三种品种公猪精液质量无显著相关性；选择HSF-1、VDAC2和WIP1作为种公猪精液质量的候选基因。