[发明专利]促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种促进tsh_s、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，其特征在于，它按照如下的步骤依次进行：

S1. 目的基因的克隆

以禽致病性大肠杆菌基因为模板，利用引物分别扩增tsh基因、bor基因和yncE基因，其中，引物序列如下：

tsh基因上游引物：5’-CCGGAATTCGATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’，

tsh基因下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’；

bor基因上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’，

bor基因下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’；

yncE基因上游引物：5’-CGGGATCCGATGCATTTACGTCATCTGTTTT-3’，

yncE基因下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACAGCGCAATACGAATCAC-3’；

S2. yncE基因连接pETDuet-1质粒

将S1扩增所得的yncE基因连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，酶切回收带有酶切位点的yncE基因并连接入pETDuet-1质粒，经转化，筛选阳性克隆，提取pETDuet-1/yncE质粒作模板，利用引物扩增yncE2基因；

其中，yncE2基因上游引物序列：5’-ACATGCATGCATGCGTCCGGCGTAGAGG-3’，

yncE2基因下游引物序列：5’-ACATGCATGCACCCCTCAAGACCCGTTTAG-3’；

S3. tsh基因和bor基因连接pETDuet-1质粒

将S1扩增所得的tsh基因和bor基因分别连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，分别酶切回收带有酶切位点的tsh基因和bor基因并依次连接入pETDuet-1质粒，经转化，筛选阳性克隆，提取pETDuet-1/tsh/bor质粒；

S4. yncE2基因连接pETDuet-1/tsh/bor质粒

将S2扩增所得的yncE2基因连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，酶切回收带有酶切位点的yncE2基因并连接入pETDuet-1/tsh/bor质粒，经转化，筛选yncE2基因与tsh基因和bor基因序列方向相反的克隆，提取pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒，即为促进tsh_s、yncE基因胞外表达的质粒。