[发明专利]促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种促进tsh_s、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用，该质粒DNA序列中包括温度敏感血凝素tsh基因、胞膜脂蛋白bor基因和囊泡蛋白yncE基因，其中，tsh基因由温度敏感血凝素转运蛋白tsh_β基因和温度敏感血凝素效应蛋白tsh_s基因组成。该质粒的构建包括目的基因的克隆、yncE基因连接pETDuet‑1质粒、tsh基因和bor基因连接pETDuet‑1质粒及yncE2基因连接pETDuet‑1/tsh/bor质粒等步骤。本发明将上述质粒转化入表达菌株细胞，使目的蛋白共表达，用于制备基因工程菌疫苗的引物特异性强、灵敏度高。本发明的方法能够促进tsh_s、yncE基因胞外表达高效表达有活性蛋白，所制得疫苗防治效果突出。

技术领域

本发明属于基因工程菌疫苗技术领域，涉及一种促进多基因共表达的质粒，具体地说 是促进tsh_s、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用。

背景技术

禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Eschirechia coli，APEC)具有专一的 毒力因子，可引起鸡、火鸡及其他禽类急性全身性肠外感染，其引起的禽大肠杆菌病 (AvianColibacillosis，AC)临床上以心包炎、肝周炎、气囊炎、蜂窝组织炎为典 型症状的大肠杆菌败血症和输卵管炎、腹膜炎、雏鸡脐炎肿头综合征等较为常见，是 目前导致世界养禽业特别是肉鸡业经济损失最为严重的细菌性传染病。

APEC有多种不同的毒力基因，其中，温度敏感血凝素(tsh)基因中包含有温度 敏感血凝素转运蛋白(tsh_β)基因和温度敏感血凝素效应蛋白(tsh_s)基因两部分功 能基团，位于ColⅤ质粒上，与雏鸡的早期AC感染有关。tsh_s基因是双功能蛋白编码 基因，所编码的效应蛋白Tsh_s兼具粘附和蛋白水解功能，使得tsh基因可作为APEC 菌株的特定遗传标志。

现有技术中，禽大肠杆菌病仍然主要通过消除易感因素或药物防控，但随着耐药菌株及药物残留问题的增加，禽产品质量安全愈来愈受到人们重视，因此，仍需要研 发非抗生素途径特别是通过接种疫苗方式防控禽大肠杆菌病。然而，由于大肠杆菌血 清型众多且不同血清型甚至同血清型的不同菌株之间也缺乏交叉免疫，给利用疫苗防 治本病带来极大挑战，限制大肠杆菌病疫苗广泛使用。同时，大肠杆菌单独表达tsh 基因呈包涵体表达的现象，该种蛋白不具备蛋白活性无法实现后续的疫苗制备，tsh 基因所表达的Tsh效应蛋白作为一种自转运分泌蛋白，在工程菌中却很难实现其自转 运分泌功能，影响基因工程菌疫苗的制备。

发明内容

本发明的一个目的，是提供一种促进tsh_s、yncE基因胞外表达的质粒，通过选 择特定基因，利用蛋白间相互作用的原理，解决Tsh效应蛋白和YncE蛋白胞外分泌 与活性问题，构建促进tsh_s、yncE基因胞外表达的质粒，实现可用于制备禽大肠杆 菌病基因工程菌疫苗的目的；