[发明专利]鉴别“仙斛系列”铁皮石斛的特异性分子标记引物及方法在审
| 申请号： | 202110913989.5 | 申请日： | 2021-08-10 |
| 公开（公告）号： | CN113981120A | 公开（公告）日： | 2022-01-28 |
| 发明（设计）人： | 李振皓;李明焱;周莎莎;熊晖;蒋燕燕;王晓彤;陈美红 | 申请（专利权）人： | 浙江寿仙谷医药股份有限公司;金华寿仙谷药业有限公司;浙江寿仙谷植物药研究院有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 | 代理人： | 冷红梅 |
| 地址： | 321200 浙江省*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 鉴别 系列 铁皮 石斛 特异性 分子 标记 引物 方法 | ||
1.用于鉴别“仙斛系列”铁皮石斛品系的特异性分子标记引物，其引物序列如下：
上游引物DK001-F：5’-AACTGACATGCAAGAGTCGC-3’；
下游引物DK001-R：5’-ATCTGCCAGCAAGGATGAGG-3’。
2.一种利用权利要求1所述引物对“仙斛系列”铁皮石斛品系进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测铁皮石斛样品的基因组DNA作为模板，以所述特异性分子标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果250bp和1500bp之间无DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛1号”；若电泳结果出现250bp和1500bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛2号”；若电泳结果出现唯一1500bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛3号”；若电泳结果出现唯一250bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛4号”；所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物DK001-F：5’-AACTGACATGCAAGAGTCGC-3’；
下游引物DK001-R：5’-ATCTGCCAGCAAGGATGAGG-3’。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：92～98℃预变性200～500s；92～98℃变性40～60s，58～64℃退火30～40s，68～72℃延伸60～90s，共30～35个循环；最后于68～72℃延伸400～600s。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)取待测铁皮石斛种质0.3～0.5g，利用CTAB法提取待测样本的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，以分子特异性标记引物为扩增引物，进行PCR扩增；
所PCR反应体系组成如下：
2*Taq MasterMix(Dye) 10μL
10μmol/L上游引物 1～2μL
10μmol/L下游引物 1～2μL
50ng/μL DNA模板 2～4μL
ddH2O 补足至20μL；
PCR扩增条件如下：94℃预变性300s；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸90s，共30～35个循环；最后于72℃延伸600s；(3)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得的PCR扩增产物，利用凝胶成像系统进行成像拍照；若电泳结果250bp和1500bp之间无DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛1号”；若电泳结果出现250bp和1500bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛2号”；若电泳结果出现唯一1500bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛3号”；若电泳结果出现唯一250bp的特异DNA条带，则待测铁皮石斛品种为“仙斛4号”。
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