[发明专利]一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法

权利要求书

1.一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，所述探针包括：多肽序列Fmoc-A(2NI)VE基元和含有荧光染料具有荧光成像功能的多肽组装基元IR780-A(2NI)VE；制备方法包括如下步骤：

S1：设计合成具有NTR还原性的2-硝基咪唑修饰的丙氨酸非天然氨基酸(Fmoc-A(2NI))；基于光延反应，在无水四氢呋喃溶剂里，偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)和三苯基膦(TPP)存在时，2-硝基咪唑与三苯甲基保护的丝氨酸甲酯(Trt-_L-Ser-OMe)反应生成Trt-A(2NI)-OMe；随后用三氟乙酸(TFA)和氢氧化锂(LiOH)处理相应的中间体以去除三苯甲基并水解甲基酯基团；随后，最终对A(2NI)的氨基进行芴甲氧羰基(Fmoc)保护，生成Fmoc-A(2NI)，用于标准Fmoc固相多肽合成(SPPS)；

S2：在非天然氨基酸Fmoc-A(2NI)的基础上进行多肽序列固相合成；多肽序列的合成是通过标准Fmoc固相多肽合成(SPPS)方法合成，以哌啶作为脱保护剂，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)为缩合剂，合成了多肽组装基元芴甲氧羰基-丙氨酸(2-硝基咪唑)-缬氨酸-谷氨酸(Fmoc-A(2NI)VE)多肽分子，分别考察了它的NTR响应性以及酶还原前后的组装形貌变化；

S3：在合成的具有NTR还原性及形貌转变的多肽分子Fmoc-A(2NI)VE的基础上，通过硫醇亲核取代反应将IR780近红外荧光分子共价连接到A(2NI)VE三肽上得到含有染料分子具有荧光成像功能的多肽组装基元IR780-丙氨酸(2-硝基咪唑)-缬氨酸-谷氨酸(IR780-A(2NI)VE)；

S4：以多肽序列Fmoc-A(2NI)VE作为自组装基元，将IR780-A(2NI)VE与Fmoc-A(2NI)VE以5：95的摩尔比例进行共组装，得到多肽共组装体系溶液，再经过退火后得到乏氧响应形貌转变的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，其特征在于：

所述考察NTR响应性的多肽序列是Fmoc-A(2NI)VE。

3.根据权利要求1所述的一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，其特征在于：

所述酶还原前后的组装形貌变化的多肽序列是Fmoc-A(2NI)VE。

4.根据权利要求1所述的一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，其特征在于：

所述含有荧光染料具有荧光成像功能的多肽组装基元是包含近红外荧光染料IR780功能化多肽IR780-A(2NI)VE。

5.根据权利要求1所述的一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，其特征在于：

含有荧光染料具有近红外荧光成像功能的多肽组装基元占多肽共组装体系的总摩尔数的比例在5％；所述多肽共组装体系溶液的物质的量浓度在0.1微摩尔每升到10毫摩尔每升；所述多肽共组装体系溶液的退火温度在10-100℃之间，所述的退火时间为0.1-100小时，溶剂为缓冲液或水，其中水为超纯水、去离子水或Milli-Q水。

6.根据权利要求1所述的一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，其特征在于：

所述NTR还原响应的形貌转变多肽纳米探针的还原条件为硝基还原酶NTR和还原性辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH；NTR浓度范围在0.1微克每毫升到100微克每毫升，NADPH浓度范围在0.1毫摩尔每升到1毫摩尔每升；温度在37℃，还原时间为0.1-100小时。

7.根据权利要求1所述的一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，其特征在于：

在NTR还原响应形貌转变多肽纳米探针的细胞实验中，使用的正常细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)；细胞实验中使用的癌细胞为小鼠乳腺癌细胞(4T1)。

8.一种可用于硝基还原酶响应肿瘤乏氧荧光探针，其特征在于：通过权利要求1-7任一项方法制备得到。