[发明专利]一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法

说明书

一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法。基于光延反应，合成了具有硝基还原酶(NTR)响应性的2‑硝基咪唑修饰的丙氨酸(Fmoc‑A(2NI))。在该非天然氨基酸的基础上合成了具有还原响应形貌转变的多肽序列Fmoc‑A(2NI)VE，以及荧光分子IR780共价修饰的多肽衍生物，通过共组装的方式制备了超分子纳米探针。本发明的优点是:开发了一种硝基还原酶响应的可用于调控多肽组装和荧光探针制备的非天然氨基酸，构筑而成的纳米探针具有硝基还原酶作用下荧光显著增强的特点，以及乏氧响应性组装形貌转变，具有良好的肿瘤深度乏氧区域近红外荧光成像的性质。制备方法简单，易于工业化生产，应用领域范围广阔。

技术领域

本发明涉及非天然氨基酸调控多肽组装及多肽纳米探针技术领域，具体涉及一种可用于多肽可控组装的硝基还原酶响应氨基酸与荧光探针的制备及性能表征方法。

技术背景

多肽纳米组装体的结构特征与多肽序列之间有着密切关系。这也激发了基于刺激响应的天然或非天然氨基酸的各种多肽可控组装系统的建立。利用生物相容性刺激调控多肽组装体的纳米结构已被证明是一种制备先进功能生物材料的有效策略，在疾病诊断和治疗方面具有巨大的潜力。在生物相容性刺激物中，硝基还原酶(NTR)是一种含有黄素的酶，通常在实体瘤的乏氧区域过度表达，能够利用辅酶NAD(P)H作为电子源将硝基还原为氨基。目前为止，许多NTR响应的水凝胶，成像探针和可激活的前药递送载体已经被设计合成，并表现出广泛的生物医学应用。尽管如此，通过NTR响应的氨基酸来调控多肽组装的有效策略仍然很少，限制了多肽材料在肿瘤乏氧区域的应用。

在NTR响应基团中，2-硝基咪唑的疏水性硝基官能团能够在乏氧条件下被NTR还原为亲水性的氨基，这种可靠而稳定的转化使得2-硝基咪唑成为NTR响应体系的理想候选之一。例如，2-硝基咪唑共价修饰荧光染料或聚合物已经被广泛用于乏氧荧光成像以及还原响应聚合物胶束药物载体的制备。然而，通过2-硝基咪唑修饰氨基酸来设计NTR调控多肽组装体系的研究还未报道。因此，通过合理设计NTR响应的2-硝基咪唑修饰的非天然氨基酸对多肽材料在肿瘤乏氧区域的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术存在的上述缺陷，提供一种通过合理设计2-硝基咪唑修饰的非天然氨基酸调控多肽组装以及制备还原响应形貌转变的多肽纳米探针。这种NTR还原响应形貌转变多肽纳米探针在乏氧区域NTR作用下，多肽中的2-硝基咪唑发生还原，由非极性硝基转变为极性氨基，促使多肽组装体发生纳米纤维到纳米颗粒的转变，从而促进多肽组装体向肿瘤深处的渗透。而且该还原反应能够阻断荧光染料与2-硝基咪唑之间的光致电子转移(PET)作用，从而对肿瘤深度乏氧区域进行近红外荧光成像。该多肽纳米探针制备方法简单，反应条件温和，操作简便。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种硝基还原酶响应氨基酸及肿瘤乏氧荧光探针的制备方法，所述的肿瘤乏氧荧光探针，简称多肽纳米探针，该探针包括：多肽序列Fmoc-A(2NI)VE基元和含有荧光染料具有荧光成像功能的多肽组装基元IR780-A(2NI)VE；所述探针通过如下方法制备而成：

S1：设计合成具有NTR还原性的2-硝基咪唑修饰的丙氨酸非天然氨基酸(Fmoc-A(2NI))。基于光延反应，在无水四氢呋喃溶剂里，偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)和三苯基膦(TPP)存在下，2-硝基咪唑与三苯甲基保护的丝氨酸甲酯(Trt-_L-Ser-OMe)反应生成Trt-A(2NI)-OMe。随后用三氟乙酸TFA和氢氧化锂LiOH处理相应的中间体以去除三苯甲基并水解甲基酯基团。随后，最终对A(2NI)的氨基进行Fmoc保护，生成Fmoc-A(2NI)，用于标准Fmoc固相多肽合成(SPPS)；