[发明专利]一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物、筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物，其特征在于：包括RNF149蛋白、RNF123蛋白、ARMC8蛋白、PCNP蛋白、FBXO9蛋白、FBXL18蛋白中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的蛋白标志物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）不同年龄人类RPE细胞的收集；

（2）不同年龄人类RPE细胞的全蛋白提取；

（3）不同年龄人类RPE细胞的分泌蛋白提取；

（4）生物质谱样品的制备；

（5）生物质谱分析；

（6）人类RPE细胞年龄相关细胞全蛋白分析；

（7）不同年龄眼球捐献者hRPE细胞年龄相关分泌蛋白分析；

（8）年龄相关蛋白在不同年龄眼球捐献者RPE细胞中的表达验证，最后筛选出相关蛋白标志物。

3.根据权利要求2所述的蛋白标志物的筛选方法，其特征在于：步骤（1）的具体操作过程为：

①摘取捐献者的眼球（去世72小时以内）眼球，用青链霉素混合液过夜浸泡消毒；去除角膜、晶状体以及玻璃体，分离去掉视网膜神经上皮层，将眼球后段制成眼杯；

②将眼杯置于10cm培养皿中，用毛细吸管轻轻从眼杯中吸出视网膜神经上皮层；以PBS液漂洗眼杯2次，吸干；

③向眼杯中加入0.25%胰蛋白酶-EDTA的消化液，于37℃恒温箱中消化20min；

④加入有血清的培养基，中止消化，吸出眼杯内的细胞悬液，离心（1000r/min）5min，弃上清，加入有血清培养基重悬细胞，置于培养瓶中培养；

⑤用PBS清洗眼杯后，再次消化20 min，收集细胞悬液，离心（1000r/min）5min，弃上清，加入有血清培养基重悬细胞，置于培养瓶中培养。

4.根据权利要求3所述的蛋白标志物的筛选方法，其特征在于：步骤（2）的具体操作过程为：

①培养上述不同年龄人类RPE细胞，待细胞贴壁长至50%以上后，去除培养基，用PBS洗3次，加入1.5 mL的PBS用细胞刮刀将细胞刮下，2000 rpm离心3 min，去除上清，收集细胞；

②向收集的细胞中加入500 μL含有cocatail的NETN裂解液，超声裂解；将超声后的细胞裂解液20000 g离心30 min；取上清；

③用Brandford法分别测定样本浓度，并将样本浓度定量到1 μg/μL。

5.根据权利要求4所述的蛋白标志物的筛选方法，其特征在于：步骤（3）的具体操作过程为：

①培养上述不同年龄人类RPE细胞，当细胞贴壁并长致70-80%左右后，去除培养基；利用生理盐水润洗细胞3次，加入无血清培养基继续培养24 h；

随后收集无血清培养基，并用超滤管（5 KDa）将其浓缩至100 μL；随后向样品中分别加入50 μL含有cocatail的NETN裂解液，超声裂解；将超声后的细胞裂解液20000 g离心30min，

取上清；

②用Brandford法分别测定样本浓度，并将样本浓度定量到0.5 μg/μL。