[发明专利]一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物、筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物，包括RNF149蛋白、RNF123蛋白、ARMC8蛋白、PCNP蛋白、FBXO9蛋白、FBXL18蛋白中的至少一种。本发明针对不同年龄阶段的眼球捐献者的视网膜色素上皮细胞中存在差异表达蛋白，例如RNF149蛋白、RNF123蛋白、ARMC8蛋白、PCNP蛋白、FBXO9蛋白和FBXL18蛋白；说明这些差异表达蛋白可以单独或联合作为预测视网膜衰老进程的蛋白标志物；进一步地，本发明以这些差异表达蛋白作为变量对不同年龄对应的视网膜色素上皮细胞进行评估，具有更高的灵敏度和特异性，能够较为准确地进行预测。

技术领域

本发明属于眼部衰老相关疾病检测和治疗技术领域，具体涉及一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物、试剂盒及其筛选方法和应用。

背景技术

衰老是“随时间不断逐步积累的对疾病的易感性”，随着年龄增长，衰老细胞在组织中逐渐累积，进而导致组织或个体的正常和病理性老化。衰老也是多种眼部疾病的主要诱因，如年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）。大量研究表明，AMD的发生与视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞的衰老及功能降低密切相关。临床及体外研究发现，老年人RPE细胞的复制能力及对损伤应答能力在衰老过程中不断减退，吞噬功能不断下降，导致过度代谢产物堆积，尤其是脂褐素的沉积。进一步，研究发现这些代谢废物可以触发慢性炎症，进而导致drusen的沉积。年龄相关性眼部疾病研究（Age-Related Eye Disease Study，AREDS）流行病学调查显示，到2020年，AMD患病人数将达约8000万，将成为严重的公共卫生问题。随着生活习惯和社会环境的改变，我国AMD患病率也呈上升趋势，这将带来巨大的经济与社会负担。因此需要寻找一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物。

发明内容

本发明的目的是提供一种原理科学、操作方便的一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种预测视网膜衰老进程的蛋白标志物，包括RNF149蛋白、RNF123蛋白、ARMC8蛋白、PCNP蛋白、FBXO9蛋白、FBXL18蛋白中的至少一种。

蛋白标志物的筛选方法，包括以下步骤：

（1）不同年龄人类RPE细胞的收集；

（2）不同年龄人类RPE细胞的全蛋白提取；

（3）不同年龄人类RPE细胞的分泌蛋白提取；

（4）生物质谱样品的制备；

（5）生物质谱分析；

（6）人类RPE细胞年龄相关细胞全蛋白分析；

（7）不同年龄眼球捐献者hRPE细胞年龄相关分泌蛋白分析；

（8）年龄相关蛋白在不同年龄眼球捐献者RPE细胞中的表达验证，最后筛选出相关蛋白标志物。

步骤（1）的具体操作过程为：

①摘取捐献者的眼球（去世72小时以内）眼球，用青链霉素混合液过夜浸泡消毒；去除角膜、晶状体以及玻璃体，分离去掉视网膜神经上皮层，将眼球后段制成眼杯；

②将眼杯置于10cm培养皿中，用毛细吸管轻轻从眼杯中吸出视网膜神经上皮层；以PBS液漂洗眼杯2次，吸干；

③向眼杯中加入0.25%胰蛋白酶-EDTA的消化液，于37℃恒温箱中消化20min；

④加入有血清的培养基，中止消化，吸出眼杯内的细胞悬液，离心（1000r/min）5min，弃上清，加入有血清培养基重悬细胞，置于培养瓶中培养；

⑤用PBS清洗眼杯后，再次消化20 min，收集细胞悬液，离心（1000r/min）5min，弃上清，加入有血清培养基重悬细胞，置于培养瓶中培养。

步骤（2）的具体操作过程为：