[发明专利]多重引导RNA

权利要求书

1.一种脱氧核糖核酸(DNA)分子，包括：

编码crRNA的多个序列，其中每个crRNA侧翼是至少一个Csy4切割序列，该Csy4切割序列由序列GTTCACTGCCGTATAGGCAG(SEQ ID NO:1)组成；

和编码tracrRNA的序列。

2.如权利要求1所述的DNA分子，可操作地连接至启动子序列。

3.如权利要求1或2所述的DNA分子，包括两个、三个、或更多个crRNA序列。

4.如权利要求2所述的DNA分子，其中该启动子序列是RNA聚合酶II(PolII)启动子或PolIII启动子。

5.如权利要求2所述的DNA分子，其中该启动子序列是RNA Pol II启动子。

6.如权利要求5所述的DNA分子，其中该Pol II启动子选自下组，该组由以下各项组成：CAG、EF1A、CAGGS、PGK、UbiC、CMV、B29、结蛋白、内皮因子、FLT-1、GFPA、和SYN1启动子。

7.一种DNA分子，包括与一个、两个、三个或更多个盒连接的启动子序列，这些盒包括：连接至Csy4切割位点的、编码crRNA的序列，该Csy4切割位点由GTTCACTGCCGTATAGGCAG(SEQID NO：1)组成；和编码tracrRNA的序列。

8.如权利要求7所述的DNA分子，包括：

Pol II启动子，该Pol II启动子可操作地连接至编码第一crRNA的第一序列，该第一序列连接至一个Csy4切割位点，该Csy4切割位点连接至编码第二crRNA的第二序列，该第二序列连接至一个Csy4切割位点，该Csy4切割位点连接至编码第三crRNA的第三序列，该第三序列连接至Csy4切割位点。

9.如权利要求7所述的DNA分子，包括约100nt的crRNA序列。

10.如权利要求1或7所述的DNA分子，进一步包括编码功能性Csy4酶的序列。

11.如权利要求1或权利要求7所述的DNA分子，其中该crRNA序列包括：(X_17-20)GTTTTAGAGCTAGAAA(SEQ ID NO:15)；以及该tracrRNA序列包括：TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQ ID NO:16)；

其中X_17-20是与靶序列的、优选是紧接前间区序列邻近基序(PAM)的5’的靶序列的17-20个连续核苷酸的互补链互补的序列。

12.如权利要求1或权利要求7所述的DNA分子，包括在该分子的3’端的一个或多个U。

13.一种RNA分子，由如权利要求1-12任一项所述的DNA分子编码。

14.一种载体，包括如权利要求1-12任一项所述的DNA分子。

15.如权利要求14所述的载体，进一步包括编码功能性Csy4酶的序列。

16.一种在细胞中产生多个crRNA的方法，该方法包括在体外使所述细胞与如权利要求13所述的RNA分子接触。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞并且所述细胞还表达外源功能性Csy4酶序列。