[发明专利]多重引导RNA

说明书

本申请涉及多重引导RNA。用于任选地在哺乳动物细胞中将高活性CRISPR引导RNA(gRNA)从RNA聚合酶II和III启动子进行多重表达的方法和构建体。本发明至少部分地基于Csy4的发现，Csy4是一种内切核糖核酸酶，该内切核糖核酸酶识别短RNA发夹序列，可以用于切下在单个较长RNA转录物上编码的多功能gRNA(产生自RNA pol II或III启动子)，在该较长RNA转录物中的各个gRNA由Csy4切割位点隔开。

本申请是中国专利申请201480076396.6的分案申请，原申请201480076396.6的申请日为2014年09月18日，其名称为“多重引导RNA”。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年12月26日提交的临时专利申请61/921,007；2014年3月14日提交的临时专利申请14/211,117；2014年3月14日提交的PCT/US 2014/029068；2014年3月14日提交的PCT/US 2014/028630；2014年3月23日提交的PCT/US 2014/035162；和2014年3月14日提交的PCT/US 2014/029304的权益。所有以上内容均通过引用结合在此。

联邦资助的研究或进展

本发明是由国立卫生研究院授予的在授权号DP1 GM105378下的政府支持所完成的。政府在本发明中享有一定的权利。

技术领域

描述的是用于任选地在哺乳动物细胞中将高活性CRISPR引导RNA(gRNA)从RNA聚合酶II和III启动子进行多重表达的方法和构建体。

背景

Cas9核酸酶形成了可编程RNA引导的成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR关联的(Cas)系统(Wiedenheft(魏登赫夫特)等人，自然(Nature)482,331-338(2012)；Horvath(霍瓦特)等人，科学(Science)327,167-170(2010)；Terns(腾斯)等人，微生物学当前观点(Curr Opin Microbiol)14,321-327(2011))，在体外、在哺乳动物细胞中、和在活模式生物，例如斑马鱼中，该系统可以用于产生靶DNA序列中的位点特异性断裂(王(Wang)等人，细胞(Cell)153,910-918(2013)；沈(Shen)等人，细胞研究(Cell Res)(2013)；迪卡洛(Dicarlo)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)(2013)；姜(Jiang)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol)31,233-239(2013)；季聂克(Jinek)等人，Elife 2,e00471(2013)；黄(Hwang)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol)31,227-229(2013)；丛(Cong)等人，科学(Science)339,819-823(2013)；马里(Mali)等人，科学(Science)339,823-826(2013c)；丘(Cho)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol)31,230-232(2013)；格拉茨(Gratz)等人，遗传学(Genetics)194(4):1029-35(2013))。短的大约100nt引导RNA(gRNA)与Cas9复合并且指导核酸酶至特异性靶DNA位点；靶向是由在gRNA的5’端的至少17-20个核苷酸(nt)的序列介导的，该序列被设计为经由工程化的gRNA的前17-20个核苷酸和紧接前间区序列邻近基序(PAM)，例如匹配序列NGG或NAG的PAM定位的感兴趣的靶基因组DNA序列的互补链之间的简单碱基对互补性互补和相互作用(沈(Shen)等人，细胞研究(Cell Res)(2013)；迪卡洛(Dicarlo)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)(2013)；姜(Jiang)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol)31,233-239(2013)；季聂克(Jinek)等人，Elife 2,e00471(2013)；黄(Hwang)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol)31,227-229(2013)；丛(Cong)等人，科学(Science)339,819-823(2013)；马里(Mali)等人，科学(Science)339,823-826(2013c)；丘(Cho)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol)31,230-232(2013)；季聂克(Jinek)等人，科学(Science)337,816-821(2012))。gRNA还可以指导催化失活的Cas9蛋白(称为dCas9，参见季聂克(Jinek)等人，科学(Science)337:816–821(2012))，该蛋白进而与效应物结构域(例如转录活化结构域)融合，参见例如2013年3月15日提交的USSN 61/799,647，和2013年6月21日提交的61/838,148，将这二者通过引用结合在此。后面的系统使得异源效应物结构域的RNA引导的募集能够到达感兴趣的基因组座位。