[发明专利]一种新的甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种新的甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体及其应用，属于生物技术领域。所述甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID NO：2所示序列突变形成；所述序列突变的位点选自以下一个或几个氨基酸残基位点：395位、425位、430位、433位、437位、438位、441位、445位。本发明通过构建甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体的重组工程菌，以甘草次酸为底物发酵催化可以获取甘草酸，并且相对于野生型工程菌，甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体催化甘草次酸产生甘草酸的产量显著提高，底物甘草次酸的摩尔转化率高达95％左右，甘草酸产量可提升到6‑8g/L以上。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体、以甘草次酸为底物微生物合成甘草酸的工程菌的构建及应用。

背景技术

甘草作为一种常用中药，已被人们接受和使用，甘草酸是从甘草中提取出的活性成分，具有以下生物活性:对于癌细胞的生长有一定的抑制功效，可以用来治疗肝癌；具有抗肝中毒的功效，可以用来治疗中毒性肝病；可有效地降低谷丙转氨酶的含量，恢复细胞的功能，对于治疗酒精肝或者是脂肪肝有着显著的功效；具退黄作用，用来治疗黄疸型肝炎。因此，如何快速合成甘草酸成为了当代社会聚焦的问题。目前，甘草酸的主要来源依然为甘草原植物，种植甘草周期长，且种植品种质量参差不齐，过量采挖造成甘草资源严重匮乏，同时破坏生态环境，仅依靠从甘草原植物中提取甘草酸无法满足市场需求，因此，寻找合理、高效获取甘草有效成分的新方法亟不可待。

甘草酸是甘草次酸在鸟苷二磷酸依赖的葡糖醛酸基转移酶(UGAT)下转化生成甘草酸，虽然都可以生成甘草酸，但甘草酸的含量却极低，主要是因为这些酶大多来源于真核细胞，真核细胞源酶在原核细胞中表达时通常不可溶，而影响甘草酸的产量。本发明通过生物信息学技术挖掘到可以在大肠杆菌中可溶表达的UGAT，并通过对野生型甘草次酸葡糖醛酸基转移酶的特定位点进行突变得到甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体，利用该突变体催化甘草次酸产甘草酸，产量明显提高。进一步还可通过与分子伴侣共表达，促进肽链的正确折叠，大大增加了酶的可溶性表达，使甘草酸产量进一步提高，为大规模工业化生产甘草酸提供了支撑。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体。

本发明的另一个目的在于提供一种以甘草次酸为底物生产甘草酸的工程菌株及其构建方法。

本发明还有一个目的在于提供一种以甘草次酸为底物合成甘草酸的工程菌的构建以及利用其以甘草次酸为底物生产甘草酸的方法。

本发明提供一种甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体，所述甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体为以下任一项所述的氨基酸序列：

a：所述甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID NO：2所示的序列突变形成；所述序列突变的位点选自以下一个或几个氨基酸残基位点：395位、425位、430位、433位、437位、438位、441位、445位。

b：所述甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体的氨基酸序列为具有与a所述的氨基酸序列至少95％以上的序列同一性；

进一步地，所述甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体的氨基酸序列为具有与a所述的氨基酸序列98％以上的序列同一性；更优选为所述甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体的氨基酸序列为具有与a所述的氨基酸序列99％以上的序列同一性；

c：所述甘草次酸葡糖醛酸基转移酶突变体的氨基酸序列由a所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端取代、添加或缺失一个或几个氨基酸残基而形成；

上述所有氨基酸突变体都具有催化甘草次酸生成甘草酸的功能。

优选的是，a中所述序列突变选自以下一个或几个氨基酸残基位点突变为如下所示的氨基酸残基：

395位：Asp、Ala；