[发明专利]一种TLR8基因人源化动物模型的构建方法及应用

说明书

本发明提供了一种TLR8基因人源化的非人动物的构建方法，利用同源重组的方式，将小鼠的TLR8基因部分序列替换为人TLR8的序列，使小鼠表达人源的TLR8蛋白；该小鼠模型可以稳定传代，并表达人的TLR8，采用本发明的构建方法获得的小鼠可以作为人TLR8信号机理研究、肿瘤及免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种小鼠TLR8基因的靶向载体，以及靶向载体和上述构建方法获得的非人动物及其在生物医药领域的应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人源化基因修饰动物模型的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种TLR8基因人源化基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）家族是进化上高度保守的一类模式识别受体家族，其广泛分布在免疫细胞中，因其具有识别细菌、病毒等病原体表达的高度保守分子的能力，在病原体识别诱发先天免疫激活及随后诱导适应性免疫应答中发挥关键作用。

TLR8属于定位于细胞内的一类TLRs分子，该类分子主要对病毒和细菌的核酸免疫反应，成员还有TLR7和9。已有的证据表明，人的TLR8在包括类风湿性关节炎（RA），抗磷脂综合征（APS）和炎症性肠病（IBD）等自身免疫性疾病中发挥作用。同时，TLR8也是肿瘤免疫治疗和抗病毒治疗的热门靶点。当前肿瘤免疫治疗中，最为成功的是靶向T细胞的免疫检查点单克隆抗体药物，其通过调节T细胞的活性，调动自身免疫系统攻击肿瘤细胞。但是，单药对肿瘤的应答率仍然很低，因此需要考虑和其他疗法联用。对免疫检查点药物的临床反应，与肿瘤中浸润性CD8+ T细胞（TILs，所谓的“热”肿瘤微环境）的存在密切相关。TILs很少的肿瘤，即所谓的“冷”肿瘤，对免疫检查点药物的反应往往较差。使冷肿瘤变热的一种策略是通过靶向细胞内的TLRs （TLR3，TLR7，TLR8，TLR9）来促进抗原递呈细胞（APC）的激活，增加炎症细胞因子和共刺激分子的表达，增强抗原呈递能力和CD8+ T细胞应答，并抑制T调节细胞（Treg）等免疫抑制细胞的应答。在这些TLRs靶点中，TLR8靶点就有独特的优势：1）与其他TLR（例如TLR7和TLR9）相比，TLR8在免疫细胞中表达更为广泛，在单核细胞和髓样树突细胞中广泛表达，可以介导更为广泛的抗原递呈细胞的激活，增强CD8+ T细胞应答；2）从功效的角度看，TLR8的激活足以逆转Treg细胞的免疫抑制功能，从而导致强烈的肿瘤抑制作用，同时，TLR8激活也可以诱导髓系来源的抑制细胞（MDSC）的凋亡。Treg和MDSC被认为是导致肿瘤免疫治疗失败的两类主要抑制细胞。因此，通过激活TLR8来逆转Treg和MDSC介导的免疫抑制引发有效的免疫反应，可以产生强大的抗肿瘤效果；3）从安全性的角度来看，TLR8激动剂具有更好的安全性，可以全身给药，而针对其他TLR（如TLR4、7，TLR7 / 8 dual，TLR9），当全身给药时耐受性较差，目前主要通过肿瘤内注射或局部给药使用，限制了这些靶点激动剂的应用。基于TLR8激动剂的这些优势，目前国外和国内众多药企都在开发针对TLR8的小分子激动剂用于肿瘤免疫治疗。另外，针对TLR8的激动剂也被用于抗病毒的药物研发中，吉利德公司（Gilead）开发的小分子化合物GS-9688目前处于II期临床阶段，用于慢性乙肝病毒感染的治疗。

在药物临床前研究中，小鼠被广泛的应用于药效评价、药理毒理分析等研究，应用于这些研究的前提是，作用于人源靶点的药物能够结合或激活小鼠对应的靶点，如受试药物不能和鼠源靶点结合或激活下游信号通路，则不能利用小鼠进行药效、药理毒理等评价。通过对人和小鼠的TLR8基因比较发现，小鼠中的Tlr8蛋白缺失了人TLR8蛋白识别RNA所必需的5个关键氨基酸，所以小鼠的Tlr8不能被ssRNA配体，RNA病毒或对人TLR8有效的激动剂小分子所激活。因此，无法用野生型小鼠模拟针对人源TLR8的信号转导、建立疾病模型和应用于药物评价和筛选。小鼠是临床前药物评价应用最广泛的动物模型，小鼠Tlr8蛋白因为和人TLR8氨基酸序列差异，针对人源TLR8的激动剂无法激活野生型小鼠体内的Tlr8，无法直接用野生型小鼠对人源TLR8体内功能和针对人源TLR8靶点药物的药效、药理毒理等进行研究。