[发明专利]一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂及其制备方法

权利要求书

1.一种基于生物工程蛋白的生物粘合剂，其特征在于，所述基于生物工程蛋白的生物粘合剂按照质量份数计，由溶剂30～50份、生物工程蛋白20～35份、甲壳素晶须15～20份、爬山虎吸盘多糖10～15份、单宁酸8～12份、马来酰化透明质酸6～8份、催化剂2～4份组成。

2.如权利要求1所述基于生物工程蛋白的生物粘合剂，其特征在于，所述溶剂为去离子水、注射用水、生理盐水、庆大霉素生理盐水冲洗液、林格氏液冲洗液、甘露醇冲洗液、葡萄糖冲洗液、洗必泰冲洗液、甲硝唑冲洗液、甘氨酸冲洗液或生理平衡液中的任意一种。

3.如权利要求1所述基于生物工程蛋白的生物粘合剂，其特征在于，所述生物工程蛋白为类弹性蛋白。

4.一种应用如权利要求1～3任意一项所述基于生物工程蛋白的生物粘合剂的基于生物工程蛋白的生物粘合剂的制备方法，其特征在于，所述基于生物工程蛋白的生物粘合剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一，进行生物工程蛋白的制备：将类弹性蛋白ELP载体质粒转化进毕赤酵母或大肠杆菌表达菌株，挑取单克隆菌落，利用LB培养液进行过夜培养；将过夜活化的表达种子液加入TB培养基，待菌液达到OD600数值为0.8～1.0时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷并降温到30℃进行过量表达；诱导10～12h收集菌体，用裂解缓冲液重悬，加入混合菌剂，破碎菌体，于10000～12000rpm离心，收集上清液，HPLC纯化，得类弹性蛋白ELP，备用；

步骤二，进行甲壳素晶须的制备：称取虾蟹壳，将虾蟹壳破碎成粉末，分散在3M的浓硫酸中，置于85～95℃的水浴中搅拌10～12h，去离子水稀释，离心去除上清，重复3～5次，得沉淀；将所得沉淀用去离子水重悬，转移至截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，充分透析至透析袋内悬液的pH为6.0；于600～800W功率下超声处理10～30min使沉淀完全悬浮，将所得悬液于7000～7500rpm离心，冻干5～20min，得甲壳素晶须，备用；

步骤三，进行爬山虎吸盘多糖的制备：采集爬山虎吸盘，用去离子水冲洗，置于阳光下晾晒6～8h后放入气流粉碎机进行粉碎，过80～120目筛，得爬山虎吸盘粉末；将爬山虎吸盘粉末加入乙醇溶液，水浴加热，回流提取2～4h，在60～70℃下蒸馏回收乙醇溶液，得脱脂吸盘粉末；向脱脂吸盘粉末中加入10～20倍热水温度为90～100℃的热水，浸提3～5h，离心浓缩，得爬山虎吸盘多糖浓缩液，备用；

步骤四，进行马来酰化透明质酸的制备：将透明质酸和二甲基甲酰胺置于去离子水中，室温下搅拌8～24h，得混合溶液A；向混合溶液A中加入马来酸酐，搅拌均匀，在35～80℃条件下反应12～48h，得混合溶液B；向混合溶液B中加入1mol/L的NaHCO₃溶液，调整混合溶液的pH至7～8，透析，冷冻干燥，即得马来酰化透明质酸，备用；

步骤五，按质量份数依次称取溶剂、生物工程蛋白、甲壳素晶须、爬山虎吸盘多糖、单宁酸、马来酰化透明质酸以及催化剂，备用；

步骤六，向生物工程蛋白中加入50～70倍的去离子水，在60℃加热搅拌条件下溶解，加入12mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，再加入单宁酸充分搅拌溶解，并连续导入空气；

步骤七，依次加入甲壳素晶须、爬山虎吸盘多糖、马来酰化透明质酸以及催化剂，充分搅拌溶解，反应结束后用0.5mol/L的稀盐酸调节pH至7.4，将反应物冷却至室温，透析，冷冻干燥，即得基于生物工程蛋白的生物粘合剂。

5.如权利要求4所述基于生物工程蛋白的生物粘合剂的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述类弹性蛋白与烷基类阴离子表面活性剂的摩尔比为1：(1.5～3)。

6.如权利要求4所述基于生物工程蛋白的生物粘合剂的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述混合菌剂，包括蛋白酶抑制剂、DNA酶和溶菌酶。

7.如权利要求4所述基于生物工程蛋白的生物粘合剂的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述虾蟹壳与浓硫酸溶液的混合比例为3～5％w/v。