[发明专利]一种分析膜蛋白和膜相互作用的分子测力计及其制备方法

说明书

本发明涉及一种用于分析细胞表面膜蛋白与细胞膜之间的相互作用的分子测力计。它是一种磷脂双分子层修饰的空心二氧化硅微球，表面嵌有两端分别修饰烷烃链和叠氮的DNA1。检测方案首先用二苯并环辛炔、二嗪和荧光染料FAM标记的DNA2识别细胞表面待检测的膜蛋白，紫外光照使二嗪与相应膜蛋白共价连接。然后利用浮力使细胞和分子测力计先接触后分离，烷烃链‑磷脂双分子层相互作用与膜蛋白‑细胞膜相互作用间的竞争会将膜蛋白拔出细胞膜。最后，对不同烷烃链长度制得的分子测力计处理过的细胞进行荧光成像，确定细胞表面荧光强度下降前后所使用的分子测力计上的烷烃链长度，代入光镊获得的相互作用力标尺，实现膜蛋白与细胞膜相互作用的定量。

一、技术领域

本发明涉及一种用于分析膜蛋白与细胞膜相互作用的分子测力计及其制备方法。

二、背景技术

细胞膜是一种由两性脂和蛋白质组装成的超分子复合物，膜蛋白作为细胞膜的重要成分，参与细胞的增殖、生长、信号传导等过程。细胞可以通过调节膜蛋白与形成细胞膜的脂质间的相互作用，改变膜蛋白活性、聚集、信号转导等功能。将膜蛋白拔出细胞膜所需力的检测可用于表征膜蛋白与细胞膜相互作用，加深该作用机制及其功能的理解，促进对相应生命过程与生理机制的探索。

为实现膜蛋白与细胞膜相互作用的分析，该专利制备了一种基于空心二氧化硅微球的分子测力计，建立了对膜蛋白与细胞膜相互作用水平的可视化分析方法。

三、发明内容

本发明的目的是：将特定长度烷烃链与叠氮(N3)标记DNA得到DNA1，再通过烷烃链与磷脂间的疏水相互作用力，使DNA1吸附到空心二氧化硅微球上的磷脂单分子层上，最后疏水自组装上第二层磷脂分子，形成DNA1嵌入磷脂双分子层的结构，制得一种分子测力计(图1)。检测方案首先用二苯并环辛炔(DBCO)，二嗪基团和染料FAM标记的DNA2中的核酸适配体识别细胞表面的膜蛋白，再在紫外光下将DNA2末端的二嗪基团与相应膜蛋白共价连接(图2A)，进一步利用叠氮和DBCO间的点击化学反应将分子测力计共价连接到与膜蛋白的DNA2上(图2B)，由分子测力计的浮力激发烷烃链-磷脂双分子层相互作用与膜蛋白-细胞膜相互作用间的竞争，通过改变烷烃链的长度，调节烷烃链-磷脂双分子层相互作用强弱，将膜蛋白拔出细胞膜(图2C)，从而由用光镊获得的相互作用力标尺，测得膜蛋白-细胞膜相互作用力。以MCF-7乳腺癌细胞系表面的MUC1黏蛋白为模型，制备的探针实现了对MUC1粘蛋白与细胞膜相互作用力的定量分析。

本发明通过以下技术方案来实现：

以羟基化的空心二氧化硅微球为载体，在环氧基硅烷化后共价修饰一层1，2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE磷脂)，通过疏水相互作用使特定长度烷烃链与叠氮标记的DNA1吸附在磷脂分子层上，再疏水自组装上第二层DSPE磷脂，即可制得分子测力计(图1)。通过改变烷烃链的长度可以获得一系列具有不同疏水相互作用力的分子测力计。

本发明的工作原理：

本发明提出的可对膜蛋白与细胞膜相互作用定量分析的分子测力计制备流程如图1所示。以羟基化的空心二氧化硅微球为载体，在环氧基硅烷化后先共价修饰一层1，2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE磷脂)，通过疏水相互作用使两端分别修饰特定长度烷烃链与叠氮的DNA1吸附到DSPE磷脂层上。最后，利用第二层DSPE磷脂的疏水自组装，形成DNA1嵌入磷脂双分子层的结构，得到分子测力计。