[发明专利]用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡、其制备方法及应用

权利要求书

1.一种用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述融合细胞膜纳米囊泡由两种或两种以上来自不同来源细胞的细胞膜囊泡融合而成，来自不同来源细胞的所述细胞膜囊泡过表达了不同的免疫检查点对应的受体。

2.根据权利要求1所述的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述免疫检查点对应的受体包括SIRPα变体、PD-1、CLTA-4、TIM3、LAG3和VISTA。

3.根据权利要求1或2所述的融合细胞膜纳米囊泡，其特征在于，所述不同来源细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD-1的B16F10细胞。

4.一种如权利要求1至3中任一项所述的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

选取两种或两种以上的肿瘤细胞的免疫检查点，通过对细胞进行基因工程化得到过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞，其中，过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞为两种或两种以上，每种过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞过表达一种或多种所述免疫检查点对应的受体；

分别制备衍生于过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞的单一细胞膜囊泡组分；以及

融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分，得到所述融合细胞膜纳米囊泡。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分包括：

将两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分混合，超声处理，然后在通过微型推挤机挤出，形成所述融合细胞膜纳米囊泡；

优选的，所述微型推挤机的孔径为100～400nm；

优选的，所述超声处理的时间为5～20分钟；

优选的，用DLS监测融合两种或两种以上所述单一细胞膜囊泡组分的过程；

更优选的，在所述通过微型推挤机挤出前，各所述单一细胞膜囊泡组分用不同的标记物进行标记。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述单一细胞膜囊泡组分的制备包括：

用低渗裂解缓冲液和均质器破坏过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞，得到第一溶液；

用DNase和RNase处理所述第一溶液，然后离心收集细胞膜囊泡；

用PBS混合蛋白酶抑制剂洗涤所述细胞膜囊泡，然后所述细胞膜囊泡经过超声处理后，在微型推挤机上通过400，200，100nm纳米孔聚碳酸酯膜逐步挤压得到所述单一细胞膜囊泡组分。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，过表达所述免疫检查点对应的受体的细胞包括过表达SIRPα变体的4T1细胞和过表达PD-1的B16F10细胞。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述对细胞进行基因工程化包括：

用携带有与小鼠SIRPα跨膜域融合的SIRPα变体的慢病毒转染4T1细胞后，分选并亚克隆所述4T1细胞，得到所述过表达SIRPα变体的4T1细胞；

将小鼠PD-1克隆到在C端带有DsRed标记的pCMV6哺乳动物表达载体中，然后转染B16F10细胞，得到所述过表达PD-1的B16F10细胞。

9.一种用于肿瘤免疫治疗的药物，其特征在于，包括如权利要求1至4中任一项所述的用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或如权利要求5至8中任一项所述的用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡，以及医学上可以接受的载体；

优选的，所述医学上可以接受的载体包括磷脂纳米颗粒。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物还包括包裹在所述融合细胞膜纳米囊泡内的化疗药物和/或小分子核酸药物。

11.如权利要求1至4中任一项所述的用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡，或如权利要求5至8中任一项所述的用于肿瘤免疫治疗的融合细胞膜纳米囊泡的制备方法制备得到的融合细胞膜纳米囊泡在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。