[发明专利]检测并鉴定3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR方法

说明书

本发明公开了检测并鉴定3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR方法，属于微生物检测技术领域。本发明公开用于检测并鉴定3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR扩增引物和探针，包括如下序列：扩增大肠杆菌O157:H7rfbE基因的如SEQ ID NO：1‑3所示引物对和探针；扩增沙门氏菌invA基因的如SEQ ID NO：4‑6所示引物对和探针；以及扩增单增李斯特菌hlyA基因的如SEQ ID NO：7‑9所示的引物对和探针；上述SEQ ID NO：1‑9所示序列在一次检测中共同使用。本发明可为食品中大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和单增李斯特菌3种食源性致病菌的准确、快速检测提供方法和数据支持。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，特别是涉及一种检测并鉴定3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR方法。

背景技术

食源性致病菌检测方法目前最常用的是细菌分离培养结合生化鉴定，传统的细菌鉴定需要增殖培养、选择性培养和生化鉴定3个步骤，是检测食源性致病菌的“金标准”，缺点是耗时长，通常需要5-6d，且检测灵敏度低、无法进行定量分析。随着分子生物学的发展和应用，实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)已成为一种强大的研究和诊断工具，简便、快速、灵敏和特异是qPCR满足核酸检测所需的四个关键方面，并且已经应用于食源性致病菌的检测，但是对于致病菌检测和鉴定的效果参差不齐。随着近些年新的食源性致病菌的不断出现，目前没有针对大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和单增李斯特菌3种致病菌同时进行多重荧光定量PCR检测方法相关报道，因此，亟需建立一种可同时检测大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和单增李斯特菌三种食源性致病菌的多重荧光PCR方法，并用于食品检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测并鉴定3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR方法，以解决上述现有技术存在的问题，能够准确的检测和鉴定大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和单增李斯特菌3种食源性致病菌。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供用于检测并鉴定3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR扩增引物和探针，包括如下序列：

扩增大肠杆菌O157:H7 rfbE基因的如SEQ ID NO：1-2所示的引物对和SEQ ID NO：3所示的探针；

扩增沙门氏菌invA基因的如SEQ ID NO：4-5所示的引物对和SEQ ID NO：6所示的探针；以及

扩增单增李斯特菌hlyA基因的如SEQ ID NO：7-8所示的引物对和SEQ ID NO：9所示的探针；

上述SEQ ID NO：1-9所示序列在一次检测中共同使用。

本发明还提供一种用于检测并鉴定3种食源性致病菌的试剂盒，包括所述的引物和探针。

本发明还提供一种检测并鉴定3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR方法，包括利用所述的引物和探针扩增待测样品目标菌株DNA的步骤。

优选的是，扩增反应体系包括以下组分：2×M5 GoldStar TaqMan Mixture 30μL，3种细菌上下游引物1.5μL，混合探针0.6μL，DNA模板4μL，ddH₂O补足至50μL。

优选的是，反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性3s，60℃退火并延伸30s，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。

本发明还提供一种所述的引物和探针或所述的试剂盒或所述的方法在检测并鉴定食源性致病菌中的应用。

本发明公开了以下技术效果：