[发明专利]采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺及其保存

权利要求书

1.采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)、将表皮细胞生物墨水加到生物3D打印喷头中，通过预先设置的速度和路径打印到底部放置有半透膜的培养皿内；

步骤(2)、待半透膜上细胞贴壁后，整个培养皿浸没在表皮组织培养基中培养1-2天；培养条件是37℃、5％CO₂、95％湿度；

步骤(3)、培养完成后，将培养皿内表皮组织培养基吸干，然后在培养皿外加入表皮组织培养基，进行气液临界培养10-14天，每隔两天更换一次；

所述表皮组织培养基为在表皮细胞无血清培养基的基础上，额外添加钙盐、维生素C，使得表皮组织培养基中钙离子浓度为1.0-1.8mM，维生素C浓度为25-75μg/mL；

所述的表皮细胞生物墨水包括表皮细胞悬浮液、生物材料；

所述表皮细胞为采用表皮细胞无血清培养基提取分离的原代细胞或传代细胞；

所述生物材料为大鼠鼠尾Ⅰ型胶原；

所述表皮细胞无血清培养基包括基础培养基和表皮细胞生长成分；其中，所述的基础培养基为DMEM与Ham’s F12按照体积比为3:1的混合培养基，或培养基MCDB153；所述的表皮细胞生长成分包括磷酸乙醇胺、表皮生长因子、氢化可的松、胰岛素、垂体提取物或泌乳素、转铁蛋白和钙盐；所述表皮细胞生长成分中各物质在表皮细胞无血清培养基中的浓度如下：磷酸乙醇胺1×10^-5-5×10^-4M、表皮生长因子0.1-5ng/ml、氢化可的松0.1-1μg/ml、胰岛素0.01-10μg/ml、泌乳素或垂体提取物10-50μg/ml、转铁蛋白1-10μg/ml、钙离子浓度为0.03-1.5mM；

所述表皮细胞生物墨水的制备方法包括如下步骤：

步骤1、原代表皮细胞提取及培养

1-1获取健康人皮肤组织；

1-2细胞分离及培养

a)皮肤组织在PBS缓冲液中冷藏运输；

b)用PBS缓冲液反复清洗皮肤组织，直至PBS缓冲液澄清；

c)将清洗后皮肤组织在聚维酮碘溶液中孵育一定时间；

d)用PBS缓冲液再次清洗皮肤组织多次，去除皮下脂肪组织；

e)将去除皮下脂肪组织后的皮肤组织置于1.2U/ml中性蛋白酶37℃消化1-6小时；

f)轻轻将皮肤组织中表皮和真皮剥离开来，将表皮组织剪碎后用0.25％胰蛋白酶37℃消化5-30min；然后用含体积含量为10％血清的DMEM培养基终止消化，网筛过滤后离心，收集表皮细胞接种；

g)表皮细胞接种至表皮细胞无血清培养基，且隔天更换一次表皮细胞无血清培养基；

步骤2、表皮细胞的扩增

2-1采用步骤1分离及提取的原代表皮细胞；

2-2传代培养

a)待原代表皮细胞汇合度达到80％～90％，倒掉培养瓶内的表皮细胞无血清培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞表面多次；

b)加入1-3mL0.25％胰蛋白酶，37℃消化3～6min后，显微镜下观察到细胞开始变圆，加入1-3mL体积含量为10％血清的DMEM培养基终止消化；

c)用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞悬液转移到离心管内，800～1200rpm，离心5min；将离心所得的沉淀用表皮细胞无血清培养基重悬，然后进行传代培养；

d)当表皮细胞汇合度达到60％～80％时，重复上述步骤b)和c)，最终得到第一至十代的传代培养的表皮细胞；

步骤3、表皮细胞生物墨水的制备

3-1从皮肤组织中提取原代表皮细胞或经iPSC诱导的表皮细胞；

3-2利用表皮细胞无血清培养基培养原代表皮细胞，消化原代表皮细胞并用表皮细胞无血清培养基进行传代培养，得到表皮细胞悬浮液，记作组分A；或消化传代培养的表皮细胞，并用表皮细胞无血清培养基制备表皮细胞悬浮液，记作组分A；

上述表皮细胞悬液密度为4×10⁴-1×10⁷cells/mL；

3-3低浓度中性生物材料溶液制备：利用表皮细胞无血清培养基稀释生物材料，加入10×PBS和1mol/LNaOH溶液，调节pH至7.4，记作组分B；

其中生物材料浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；

3-4将组分A和B按照体积比为1:10-1:60混合均匀，再加入表皮细胞无血清培养基混匀后制备得到表皮细胞生物墨水。