[发明专利]采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺及其保存

说明书

本发明公开采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺及其保存。本发明提出一种新配方的无血清培养基，成分明确，价格低廉；支持多种来源表皮细胞的提取及扩增；本发明在表皮组织制备过程中均可采用同一配方的无血清培养基，便可促进表皮细胞分化为具有同人体表皮类似的四层复层化结构，培养方式操作简便；表皮组织培养基仅在表皮细胞培养基的基础上增加VC和提高氯化钙的浓度，配制方法简单，可以迅速实现从细胞培养到组织制备的全过程。同时采用生物3D打印的制备方式，可以实现大规模批量化生产，减少人工制作导致的批间差异。

技术领域

本发明属于细胞学及组织工程领域，尤其涉及一种采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺及其保存。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，具有保护体内组织、调节体温、感受刺激、排泄废物和参与免疫应答等重要的生物学功能。皮肤覆盖在人体表面，易于受到伤害，如发生大面积烧伤、皮肤溃疡和皮肤撕脱伤等。表皮细胞作为皮肤最外层表皮的主要组成细胞，其增殖速度与数量成为皮肤损伤修复的关键之一。此外，随着3R(减少、替代和优化)原则的推动和体外替代科学的发展，体外表皮组织因具有与人类皮肤相似的生理结构和代谢功能在化妆品/药品安全性评价，功效性测试和毒理学研究中获得了广泛的应用。其中表皮细胞是构建体外表皮组织的重要种子细胞。

目前表皮细胞来源包括从组织中分离提取的原代细胞或通过iPSC技术诱导而成的表皮细胞，其培养和扩增有两种体系，一是有饲养层支撑的有血清培养；二是无饲养层的无血清培养。其中，含血清的培养方式主要存在下列问题：1)血清易被病毒污染；2)血清中部分物质其含量和作用目前尚未完全确定；3)血清批次间差异大，无法保证培养基的稳定性及后期产品的一致性。无血清培养体系以其成分明确，批次间差异少，有利于后期生产标准化建立而受到使用者的欢迎。虽然无血清培养基有一定研究进展，但现有的无血清培养基中添加成分普遍较为复杂、价格高昂，且细胞一般难以达到有血清培养的生长速度。

而且，目前国际国内已有的可用于体外安全性评价的重组表皮模型，如申请号为CN 201610204148.6公布了一种体外表皮模型的制备方法，其中表皮模型每一层分化都需要特定的培养基，制作过程较为复杂。同时由于缺乏先进制造技术，无法进行大规模批量化地稳定生产。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种表皮组织的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤(1)、将表皮细胞生物墨水加到生物3D打印喷头中，通过预先设置的速度和路径打印到底部放置有半透膜的培养皿内，制备得到表皮组织模型；其中，半透膜的材质为聚碳酸酯(PC)、聚酯(PE)或聚四氟乙烯(PTFE)；孔径为0.4-8μm。优选地，半透膜材质选择聚碳酸酯(PC)，孔径为0.4μm。

步骤(2)、待半透膜上细胞贴壁后，整个培养皿浸没在表皮组织培养基中培养1-2天；培养条件是37℃、5％CO₂、95％湿度。

步骤(3)、培养完成后，将培养皿内表皮组织培养基吸干，然后在培养皿外加入表皮组织培养基，进行气液临界培养10-14天，每隔两天更换一次；

在培养过程中，随机抽取表皮组织模型置于光学相干层析成像仪(OCT)下进行检测，观察模型表面是否干燥和平整。气液培养最后一天，随机抽取表皮模型置于光学相干层析成像仪(OCT)下进行检测，测量模型的三维结构形态和角质层分化情况。

表皮组织培养14天后，即可成熟，从组织结构和生理功能上均与人真实表皮组织类似。此时，培养完成的表皮组织可用于体外物质安全和功效评价。

上述表皮组织培养基在表皮细胞无血清培养基的基础上，提高其中钙盐的浓度，同时增加维生素C，支持表皮细胞分化成典型的四层复层化结构，其中表皮组织培养基中钙离子浓度为1.0-1.8mM，优选为1.2mM，维生素C浓度为25-75μg/mL，优选为50μg/mL。