[发明专利]注射衣霉素诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.注射衣霉素诱导急性肝损伤小鼠模型的构建方法，其特征在于，需要以下步骤：

1)衣霉素溶液的配制；

1-1)150mM葡萄糖溶液的配制：精密称取810.72mg葡萄糖溶于30ml灭菌水中，震荡溶解；

1-2)0.1μg/μl衣霉素TM溶液的配制：精密称取1mg衣霉素粉末溶解于100μl二甲亚砜(DMSO)中，再加入10ml的150mM葡萄糖溶液，震荡溶解，4℃保存；

1-3)1％DMSO对照液的配制：取100μl二甲亚砜DMSO溶液加入到10ml的150mM葡萄糖溶液，震荡溶解，4℃保存；

2)将7周龄C57BL/6小鼠按体重大小随机分成对照组和实验组两组，每组数量按需要分配，实验组开始腹腔注射步骤1-2)中配制的TM溶液100μl/10g，与此同时对照组腹腔注射步骤1-3)中配制的1％DMSO对照液100μl/10g，12h后处死取材；

3)观察肝脏形态、病理图并检测肝损伤相关的生化指标。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中小鼠的体重为18g-20g，均为SPF级，饲养于SPF级动物房一周，饲养环境为温度25℃、湿度为50％-55％、光照12h黑暗12h、自由进食和饮水，一周后按体重随机分为对照组。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中腹腔注射时的步骤：吸取药品，并去除气泡；将针头向上，吸取一段气体后，在缓慢排除气体，以达到取出气泡的效果；用一只手抓住小鼠的尾巴向后拉，另一只手的大拇指和食指抓小鼠的头背部皮毛，腹腔向上；将事先吸取好液体的注射器针尖平面朝上，平行扎入皮内后，注射器与腹腔呈45度角刺入腹腔，感觉针尖部分移动，注射样品。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，对照组给药具体如下：

每一只小鼠称重并记录体重，按照体重来给药，每10g的重量腹腔注射100μl配制好的浓度为1％DMSO对照液，给药12h后经摘除眼球收集血液后颈椎脱臼法处死小鼠，并收集小鼠肝脏。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中实验组给药具体如下：

每一只小鼠称重并记录体重，按照体重来给药，每10g的重量腹腔注射100μl配制好的浓度为0.1μg/μl的TM溶液，给药12h后经摘除眼球收集血液后颈椎脱臼法处死小鼠，并收集小鼠肝脏。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，肝脏分析具体如下；

将收集好的小鼠肝脏用预冷的PBS缓冲液清洗后，放于培养皿上拍照记录形态；

肝脏病理：首先取小鼠新鲜肝脏中间部位装入包埋盒中并泡在4％PFA中过夜，过夜后采用乙醇梯度脱水法脱水，按下表1程序脱水；

表1

其次，将脱好水的组织取出，用石蜡包埋机包埋组织，再用石蜡切片机切厚度为4μm的组织；按下表2步骤进行苏木素-伊红HE染色；

表2

最后，染完色后，用中性树胶封片，封片过程中要注意避免出现气泡，吹干即可，在显微镜下观察并拍照。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，血液生化指标检测具体如下：

提前在灭菌的1.5ml EP中加入5μl的肝素钠，使用前用手指弹管底，让肝素钠均匀分散在管壁上；小鼠取材前用摘眼球法取血，避免出现凝血现象；取完血后冰上静置30min，在4℃条件下3000rpm离心15min，吸取上清液即为血浆，按照血浆谷丙转氨酸ALT、谷草转氨酸AST试剂盒说明书的方法步骤进行ALT、AST的检测。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中观察肝脏形态具体如下：从肝脏形态上看，实验组肝脏呈黄色，大而软，部分区域呈黄白相间的斑纹状；HE染色病理显示实验组肝索紊乱，胞质稀疏；生化指标表明，血浆AST、ALT显著上升，此时腹腔注射衣霉素溶液从而诱导急性肝损伤的小鼠模型构建成功。