[发明专利]一种检测生物瓣膜材料中残余醛基的方法

说明书

本发明涉及生物材料检测技术领域，特别涉及一种检测生物瓣膜材料中残余醛基的方法。该方法包括如下步骤：将戊二醛交联处理后的生物瓣膜材料漂洗，研磨成粉，加入PBS缓冲液研磨成匀浆；在匀浆中加入PBS缓冲液、NAD⁺溶液、乙醛脱氢酶溶液，在20～30℃温度下反应0.5～1.5h；将所得反应液离心，检测上清液的340nm处吸光值，根据戊二醛的标准曲线得到残余醛基的浓度。本发明采用酶法检测生物瓣膜材料中的醛基含量，对于一端交联另一端未交联的醛基也能检测，不需要萃取和洗脱醛基，测得的醛基含量更为精确。该检测方法操作简单稳定，反应温和高效，成本较高效液相色谱更低，具有一定的创新意义和应用价值。

技术领域

本发明涉及生物材料检测技术领域，特别涉及一种检测生物瓣膜材料中残余醛基的方法。

背景技术

目前国际上制作生物心脏瓣膜的牛心包或猪主动脉瓣膜、以及肺动脉替代材料牛颈静脉带瓣管道均采用戊二醛交联处理。临床应用长期结果显示钙化是造成这些产品失功衰败的主要原因之一。而研究表明，引发钙化主要是由于戊二醛的残留醛基导致。由于戊二醛具有较强细胞毒性，其残余的醛基会缓慢释放抑制细胞黏附/生长，使植入生物瓣膜不易内皮化，同时也会静电吸附钙离子形成钙核引发钙化。因此，检测残余醛基对于戊二醛交联牛心包进行技术优化具有重要意义。通过检测对比不同优化方案后的牛心包的残余醛基含量，可以提出并筛选出最适合的优化方案。

现有的主流方法是高效液相色谱法，其需要：乙腈、高效液相色谱仪、2,4-二硝基苯肼以及对应的色谱柱。其原理是利用戊二醛的醛基与2，4-二硝基苯肼(DNPH)反应得到的腙产物对紫外-可见光有吸收的特性，采用液相色谱仪测定360nm处吸光值分析溶液中戊二醛的含量，文献中表明其测量精度可以达到20-28μg/L。

高效液相色谱法优点是高效、精确，但其缺点是：对于牛心包中残余的戊二醛主要为萃取，拿萃取液来反应生产衍生物，最后测量衍生物含量。这种测量方法仅对于完全未交联的游离的戊二醛有效。而戊二醛有两个醛基，该方法对于一端交联在材料表面，一端未交联的醛基基本无法测量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测生物瓣膜材料中残余醛基的方法。该方法可检测一端交联另一端未交联的醛基，测得的醛基含量更为精确。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测生物瓣膜材料中残余醛基的方法，包括如下步骤：

将戊二醛交联处理后的生物瓣膜材料漂洗，研磨成粉，加入PBS缓冲液研磨成匀浆；

在匀浆中加入PBS缓冲液、NAD⁺溶液、乙醛脱氢酶溶液，在20～30℃温度下反应0.5～1.5h；NAD⁺溶液、乙醛脱氢酶溶液的溶剂为含有2.5～3.5mol/L KCl、pH8.0～9.0的80～120mmol/L Tris-HCl缓冲液；

将所得反应液离心，检测上清液的340nm处吸光值，根据戊二醛的标准曲线得到残余醛基的浓度。

本发明利用乙醛脱氢酶和NAD⁺与-CHO反应生成羧酸和NADH，利用生成的NADH来反应醛基的含量，理论上1个游离醛基可以生成1个NADH。

作为优选，漂洗的时间为5～10d。

优选地，漂洗的时间为7d。

作为优选，研磨成粉为采用液氮研磨成粉，然后加入PBS液体及研磨珠研磨成匀浆。

作为优选，以g/umol/U计，生物瓣膜材料、NAD⁺、乙醛脱氢酶的用量比为(1～1.5)：(1.5～2):(1.5～2)。

优选地，以g/umol/U计，生物瓣膜材料、NAD⁺、乙醛脱氢酶的用量比为1.15：1.875：1.5。