[发明专利]大鼠线粒体基因G14098A的突变方法及其应用

说明书

大鼠线粒体基因G14098A的突变方法及其应用。本发明利用DdCBE碱基编辑技术，依据目标突变位点，设计两条包含突变位点的TALE靶点识别序列，通过筛选DdCBE组合，将DdCBE定位到相应的目标序列以使目标碱基由G突变为A。本发明的突变方法具有高精确性和低脱靶效应。本发明通过大鼠受精卵显微注射，能够实现大鼠的线粒体基因第14098位的G突变为A。雌性突变大鼠与野生型大鼠杂交进行突变传代分析，表明突变能够稳定传代；行为学和心脏功能评价证实该大鼠模型具有人类线粒体突变疾病表型。

技术领域

本发明涉及一种线粒体基因突变方法及其动物建模应用。

背景技术

随着生命科学和医学研究迈入新领域，对动物模型的需求正在日益上升。动物模型是疫苗、药物研发过程中不可逾越的环节，特别是重大传染病和复杂人类疾病的研究，都需要稳定有效的疾病动物模型作为支撑。

线粒体DNA(mtDNA)突变主要表现为碱基变化，它能够导致人类发生多种系统性疾病。迄今为止，人类mtDNA的致病变异已超过270种，并且数量还在不断上升。目前，仍没有针对mtDNA致病性突变的有效治疗方案。因此，迫切需求包含精确的人类mtDNA变异的动物模型来揭示这类疾病的病理生理学过程并开发针对这些疾病的治疗方法。此前，具有致病性mtDNA突变的哺乳动物动物模型可以通过线粒体移植获得或者使用PolG^D257A/WT谱系筛选新的mtDNA突变[Stewart,J.B.J Inherit Metab Dis,2020]。然而，这两种策略都不能根据需求得到具有精确mtDNA突变的动物模型。

发明内容

在人体中，mtDNA TRNE基因中的G14710A突变与线粒体肌病相关，发明人发现其在大鼠中对应的位点是G14098，并因此设计了一种基因突变方法来应用于G14098A突变大鼠建模以辅助研究相关疾病。

本发明的目的因此是提供一种精准有效的大鼠线粒体基因G14098A的突变方法及其相关应用。

根据本发明的第一方面，提供了一种大鼠线粒体基因G14098A的突变方法，包括：

在目标突变碱基G位置上下游分别选定一个TALE识别靶序列，两个TALE识别靶序列中间的间隔序列为7-18bp且不含除目标突变碱基G之外的碱基G，其中两个TALE识别靶序列与间隔序列一起限定目标突变序列；

根据选定的TALE识别靶序列筛选一对DdCBE组合；以及

共注射所筛选的DdCBE组合以将其定位于目标突变序列，从而将目标突变碱基G编辑为A而引入突变。

本发明采用由DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器(DdCBE)成功实现了mtDNA中C·G到T·A的精准转变(高精确性和低脱靶效应)，从而为建立具有特异性mtDNA突变的动物模型以及相关研究应用开辟了途径。

根据本发明的优选方案，所选定的两个TALE识别靶序列可以分别为：

左侧识别靶序列：ttaactgtgactaat(SEQ ID NO.1)；以及

右侧识别靶序列：agttgaattacggcgat(SEQ ID NO.2)。

根据本发明的进一步优选方案，所筛选的DdCBE组合可以为：

Rat G14098A Left TALE-G1333C(L1333C)和Rat G14098A Right TALE-G1333N(R1333N)；

Rat G14098A Left TALE-G1397C(L1397C)和Rat G14098A Right TALE-G1397N(L1397N)；