[发明专利]一种利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法

权利要求书

1.一种利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法，其特征在于：在浓度为0.1～50mg/mL的羊毛角蛋白溶液中加入氧化还原酶，并使所述氧化还原酶的终浓度为0.1～100mg/mL，0～50℃混匀后，加入金属离子并使其终浓度为0.8～40mM进行配位，所述金属离子包括Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺或Cu²⁺中的至少一种，随后加入氧化石墨烯溶液并使其终浓度为0.01～100mg/mL，0～50℃混匀，即得氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氧化还原酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧化还原酶包括氨基酸脱氢酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述羊毛角蛋白采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠工艺溶解羊毛制备得到；其中，羊毛、尿素、九水合硫化钠与十二烷基硫酸钠的质量比为4～20：22～50：5～20：1.4～2，溶解温度为25～65℃，反应时间2～20h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述羊毛角蛋白溶液的浓度为0.1～0.16mg/mL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸脱氢酶通过重组表达方式制备得到，将可表达所述氨基酸脱氢酶的重组表达菌株接种到含有卡那霉素的LB培养基中培养，培养一段时间后加入乳糖诱导剂IPTG；培养所得菌液，离心获取细胞，配制成细胞悬液；超声破碎并离心，收集上清液即为含有带His-tag标签的氨基酸脱氢酶的粗酶液；采用镍柱对得到的粗酶液进行纯化并除盐，得到带His-tag标签的氨基酸脱氢酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：可表达所述氨基酸脱氢酶的重组表达菌株的构建方法为：用NdeI和Xhol分别双酶切所述氨基酸脱氢酶基因和pET28a质粒，连接转化，得到pET28a-NTAaDH质粒；将上述质粒转化至E.coli BL21(DE3)，得到可表达带His-tag标签的氨基酸脱氢酶的重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：将所述E.coli BL21(DE3)/pET28a以1～3％的接种量接种到所述含有卡那霉素的LB培养基中培养，所述的LB培养基包括：胰蛋白胨5.0～15.0g/L，酵母浸膏1.0～10.0g/L，NaCl 0.0～15.0g/L，调节pH 7.0～7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为50～150μg/mL；培养条件为36～38℃，150～250rpm培养1.5～6h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5～15mg/mL，继续在25～30℃，150～250rpm下培养2～12h；培养所得菌液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀用pH 7～7.5的磷酸缓冲液重悬，充分洗涤后离心，重复操作若干次，用pH 6.5～8.0的磷酸缓冲液配制成浓度为50～150g/L的所述细胞悬液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含10μL，4mM NADH、160μL，pH 8～12浓度范围为50～200mM的氯化铵-氨水作为氨基供体、10μL，40mM的底物溶液和20μL酶液，所述底物包括2-氧代-基丁酸乙酯、苯丙酮酸或α-酮戊二酸，340nm波长下测定酶活；酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗或生成1μmol NADH所需要的酶量为一个酶活力单位。

10.一种根据权利要求1至9中任一项所述的方法所制备的氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氧化还原酶。