[发明专利]一种利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法

说明书

本发明公开了一种利用氧化石墨烯‑羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法，属于固定化酶技术领域。氧化石墨烯的结构稳定，生物相容性好，是一种优良的酶固定化载体。片层结构的氧化石墨烯有着高比表面积，高柔韧性和出色的可加工性，是一种优良的酶固定化载体。羊毛角蛋白由无规卷曲、α－螺旋和β－折叠平行多肽构象一起组成的极致密的结构，具有有效的功能化基团，与氧化石墨烯有很强的结合能力。本发明所得固定化氧化还原酶的pH稳定性和重复使用稳定性明显增强，同时具有较高的酶活性回收率。本发明的优点在于工艺简单、制备条件温和、固定化率高。

技术领域

本发明涉及固定化氧化还原酶的方法，属于酶固定化领域。

背景技术

氧化还原酶是一类能催化两分子间发生氧化还原作用的酶的总称，包括多种重要的酶类。其中，氨基酸脱氢酶(AaDH)可催化可逆的氨基酸氧化脱氨和酮酸还原胺化反应。对于非天然底物的还原胺化反应，选择底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(EOPB)在含铵盐体系中(提供NH₄⁺受体)进行还原胺化高选择性生成L-高苯丙氨酸(LHPA)。利用AaDH可合成非天然氨基酸L-高苯丙氨酸(LHPA)，以便更广泛地应用在药物、新型生物材料和化妆品等领域。

由于游离的氨基酸脱氢酶稳定性差，采用固定化的方法可进行改善。固定化酶的性能取决于固定化酶所使用的载体材料的性质和固定化方法。酶的固定化材料包括无机、有机聚合物、凝胶以及生物材料等。目前的氨基酸脱氢酶等氧化还原酶的固定技术，还存在固定化酶稳定性差，重复利用活性低等问题。因此，还有必要对固定化载体和方法进行进一步研究。

发明内容

本发明提供了一种利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法。氧化还原酶均可采用此方法，如氨基酸脱氢酶等。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法，在浓度为0.1～50mg/mL的羊毛角蛋白溶液中加入氧化还原酶，并使所述氧化还原酶的终浓度为0.1～100mg/mL，0～50℃混匀后，加入金属离子(Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺等)并使其终浓度为0.8～40mM进行配位，随后加入氧化石墨烯溶液并使其终浓度为0.01～100mg/mL，0～50℃混匀，即得氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氧化还原酶。

进一步地，所述氧化还原酶包括氨基酸脱氢酶。

优选地，所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，带有His-tag标签。

进一步地，所述羊毛角蛋白采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠(SDS)工艺溶解羊毛制备得到；其中，羊毛、尿素、九水合硫化钠与十二烷基硫酸钠的质量比为4～20：22～50：5～20：1.4～2，溶解温度为25～65℃，反应时间2～20h。

优选地，所述羊毛角蛋白溶液的浓度优选为0.1～0.16mg/mL，羊毛角蛋白溶液浓度为0.14～0.16mg/mL时固定化酶酶活最高。

氧化石墨烯(Graphene Oxide，GO)是石墨烯(Graphene)的一种重要的衍生物，具有良好的生物相容性，在生物医药、药物缓释、包装材料等领域有广阔的应用前景。GO具有和石墨烯相似的二维片层结构，通过控制化学氧化时间可以调控氧化程度。不同氧化程度的GO在碳骨架的二维平面上以及边缘带有不同数量的-OH、-COOH和-O-等含氧基团，具有不同的疏水性能，因此具有良好的生物相容性。