[发明专利]一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种大肠杆菌助溶表达质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以链霉菌DNA为模板，扩增得到伴侣基因groEL1、groES1和groEL2；

(2)将伴侣基因groEL1、groES1和groEL2克隆至删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro7上，得到助溶表达质粒pGroE。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，伴侣基因groEL1的序列如SEQ ID NO.1所示；

伴侣基因groES1的序列如SEQ ID NO.2所示；

伴侣基因groEL2的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，扩增时的反应体系为：链霉菌DNA 1μL，上下游引物各1μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，ddH₂O 22μL；

扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃～60℃30s，72℃2min～3min，共35个循环；72℃，10min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增伴侣基因groEL1的引物如SEQ IDNO.4～5所示；

扩增伴侣基因groES1的引物如SEQ ID NO.6～7所示；

扩增伴侣基因groEL2的引物如SEQ ID NO.8～9所示。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，克隆时的反应体系为：删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro71μL，伴侣基因groEL1、groES1和groEL2各1μL，2×ClonExpress Mix 5μL，ddH₂O 1μL；

克隆时的反应条件为：48～52℃反应4～6min。

6.权利要求1～5任意一项所述的方法制备得到的助溶表达质粒pGroE。

7.权利要求6所述的质粒pGroE在促进糖基转移酶可溶表达中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，pGroE在促进糖基转移酶可溶表达时的诱导剂为：质量浓度为0.4～0.6g/ml的L-阿拉伯糖和/或摩尔浓度为0.05～0.15M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，糖基转移酶由dnmS和/或dnmQ基因编码；

dnmS基因的序列如SEQ ID NO.10所示；

dnmQ基因的序列如SEQ ID NO.11所示。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，pGroE在促进dnmS和/或dnmQ基因编码的糖基转移酶可溶表达的方法为：pGroE与表达dnmS和/或dnmQ基因的质粒载体共表达；

表达dnmS基因的质粒载体为T7启动子的表达载体：pET22b-dnmS、pET28a-dnmS、pET30a-dnmS或pET32a-dnmS；

表达dnmQ基因的质粒载体为T7启动子的表达载体：pET22b-dnmQ、pET28a-dnmQ、pET30a-dnmQ或pET32a-dnmQ。