[发明专利]一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用。本发明助溶表达质粒的构建方法，包括如下步骤：(1)以链霉菌DNA为模板，扩增得到伴侣基因groEL1、groES1和groEL2；(2)将伴侣基因groEL1、groES1和groEL2克隆至删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro7上，得到助溶表达质粒pGroE。将本发明的pGroE质粒与dnmS和/或dnmQ基因编码的糖基化转移酶共表达，较pGro7质粒能显著提高其可溶性，该助溶表达质粒的开发，为解决基因表达时的包涵体问题提供了良好的解决方案。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用。

背景技术

DNA重组技术使得体外表达目的蛋白成为可能。大肠杆菌以其易于遗传操作、繁殖速度快、表达重组蛋白产量高、培养成本低等特点，优于其他蛋白质异源表达宿主，成为分子生物学研究的有力工具。然而，大肠杆菌无法实现蛋白质转录后的修饰，胞质内还原性环境不利于二硫键的形成和稳定，造成部分重组蛋白无法正确折叠，进而，容易形成无生物活性不可溶的包涵体。

解决包涵体问题的方法有降低表达温度，更换弱启动子或RBS序列，采用分子伴侣协助表达以及提高二硫键折叠效率。现有技术的这些方法在提高外源蛋白表达方面仍然有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以有效提高外源蛋白表达量的大肠杆菌助溶表达质粒及其构建方法与应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种大肠杆菌助溶表达质粒的构建方法，包括如下步骤：

(1)以链霉菌DNA为模板，扩增得到伴侣基因groEL1、groES1和groEL2；

(2)将伴侣基因groEL1、groES1和groEL2克隆至删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro7上，得到助溶表达质粒pGroE。

作为优选，伴侣基因groEL1的序列如SEQ ID NO.1所示；

伴侣基因groES1的序列如SEQ ID NO.2所示；

伴侣基因groEL2的序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选，扩增时的反应体系为：链霉菌DNA 1μL，上下游引物各1μL，2×PhantaMax MasterMix 25μL，ddH₂O 22μL；

扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃～60℃30s，72℃2min～3min，共35个循环；72℃，10min。

作为优选，扩增伴侣基因groEL1的引物如SEQ ID NO.4～5所示；

扩增伴侣基因groES1的引物如SEQ ID NO.6～7所示；

扩增伴侣基因groEL2的引物如SEQ ID NO.8～9所示。

作为优选，克隆时的反应体系为：删除groEL和groES基因片段的大肠杆菌质粒载体pGro71μL，伴侣基因groEL1、groES1和groEL2各1μL，2×ClonExpress Mix 5μL，ddH₂O 1μL；

克隆时的反应条件为：48～52℃反应4～6min。

本发明还提供了所述的方法制备得到的助溶表达质粒pGroE。

本发明还提供了所述的质粒pGroE在促进糖基转移酶可溶表达中的应用。