[发明专利]一种类泛素蛋白蛋白酶的生产方法

说明书

本发明提供一种类泛素蛋白蛋白酶的生产方法，涉及基因工程技术领域。本发明的SUMO蛋白酶的生产方法，包括：1)构建SUMO蛋白酶表达载体；2)将所述SUMO蛋白酶表达载体转化至宿主菌，筛选获得基因工程菌；3)对所述基因工程菌进行培养，从培养液中提取SUMO蛋白酶。本发明的SUMO蛋白酶表达载体的表达量高，SUMO蛋白酶的提取方法简便，适合工业化大规模生产；特别是，本发明方法生产的SUMO蛋白酶的活性高，在用于切割去除融合标签以获得目的蛋白等方面具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种SUMO蛋白酶的生产方法。

背景技术

SUMO蛋白酶是一种具有较高活性的半胱氨酸蛋白酶，来源于酵母编码的MIP1基因，能够特异性识别UBL蛋白的三级结构SUMO(Small Ubiquitin-Like Modifier)，并依赖正确的蛋白质构象；即，在仅有完整序列而没有正确结构时，SUMO蛋白酶是不能对目标蛋白进行切割的。SUMO蛋白酶是目前切割特异性最好的蛋白酶，可在较广泛的作用温度和PH范围(pH7-9)内发挥作用。

由于靶蛋白可以通过与类泛素蛋白(sumo)进行融合表达，以提高靶蛋白的可溶性；因此，高活性的SUMO蛋白酶可用于切割去除融合标签获得目的蛋白。目前，市场上SUMO蛋白酶的生物活性普遍较低，此外常规的的SUMO蛋白酶生产方法通常步骤繁琐，且成本较高。因此，提高SUMO蛋白酶的表达量及活性，同时减少生产成本，是非常有必要的。

公开号为CN 108774634 A的中国专利申请公开了一种重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET-21b-SUMO蛋白酶表达质粒的构建；S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定。该方法应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现了重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的表达。然而，该方法SUMO蛋白酶的表达量及活性提高程度有限，无法适应工业化大规模生产。

鉴于此，特提出了本发明。

发明内容

本发明提供一种SUMO蛋白酶的生产方法，利用该方法生产SUMO蛋白酶时，SUMO蛋白酶的表达量以及活性显著提高。

本发明提供一种SUMO蛋白酶的生产方法，按照下述步骤进行：

1)构建SUMO蛋白酶表达载体；

2)将所述SUMO蛋白酶表达载体转化至宿主菌，筛选获得基因工程菌；

3)对所述基因工程菌进行培养，从培养液中提取SUMO蛋白酶。

步骤1)中，所述SUMO蛋白酶表达载体为pET30a-stag-Bsulpstar。

步骤2)中，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

进一步地，步骤2)包括：

将质粒pET30a-stag-Bsulpstar与感受态细胞混匀，随后进行冰浴、水浴热击、冰浴，再于培养基中进行复苏培养；

将复苏培养后的培养液涂布于含有卡那青霉素和氯霉素的固体培养基中进行培养，培养后挑取单克隆并筛选阳性转化子，获得基因工程菌。

已经于2021年4月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22263，建议的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

进一步地，所述固体培养基中卡那青霉素的浓度为45-55μg/mL，氯霉素的浓度为30-40μg/mL。