[发明专利]一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法

说明书

本发明公开了一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。其由样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸顺次搭接粘贴在底板上构成。抗ToBRFV单克隆抗体标记胶体金后包被在金标垫上，抗ToBRFV另一个单克隆抗体和抗鼠IgG二抗分别包被在硝酸纤维素膜检测(T)线和控制(C)线。本发明的ToBRFV胶体金免疫试纸条可准确、特异、灵敏的检测田间番茄中的ToBRFV。该试纸条在5min内可通过肉眼观察检测结果，非常适合田间大批量样品检测，在实际生产中具有很好的应用价值，对ToBRFV的诊断、监测及预警提供物质支持。

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。

背景技术

病毒病严重威胁番茄的安全化生产。番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugosefruit virus，ToBRFV)是一个新发病毒，于2015年首次报道，现在已经传播到美洲、亚洲、欧洲和非洲十几个国家，2019年，ToBRFV在中国山东发生。该病毒可导致番茄果实产生褐色皱缩坏死斑或黄色斑，严重危害番茄的产量和质量。该病毒属于烟草花叶病毒属，在体外非常稳定，可存活很长时间而不丧失传染力，可通过种子传播，也可通过农事操作等接触传播。目前，商业化的番茄品种中还未有抗性基因，且尚无有效的控制手段，因此该病毒对番茄安全生产造成巨大的威胁。该病毒已经引起国际上广泛重视，多个国家已经将其列入检疫对象。

ToBRFV的检测主要有：观察植株发病症状、血清学检测和分子生物学检测；其中，植株发病症状是病毒最直观的检测方式，但ToBRFV在番茄上产生的症状与同属烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)和番茄轻斑驳病毒(tomato mild mottle virus，ToMMV)产生的症状类似，因此，发病症状不能够确认侵染病毒种类。血清学检测最常用的是酶联免疫吸附试验(ELISA)，但是，烟草花叶病毒、番茄花叶病毒和ToBRFV之间有交叉反应，因此，利用ELISA不能有效区分3种病毒。利用RT-PCR可准确检测出ToBRFV，但检测需要精密仪器和专业的操作人员，仅适用于少量样品的检测。

胶体金免疫试纸条操作简单，可在5-10分中内通过肉眼观察进行判断，对于田间应用十分适用。但由于ToBRFV、TMV、ToMV和ToMMV这4个病毒衣壳蛋白氨基酸之间一致率在85％以上，特异性识别ToBRFV胶体金试纸条的制备存在一定难度。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测番茄褐色皱果病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法。采用该胶体金免疫试纸条能快速、特异、灵敏地检测番茄样品内的ToBRFV。该试纸条在5min即可用肉眼直接判读结果，适用于田间检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一组杂交瘤细胞株，包括：分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14和分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16；上述两个杂交瘤细胞株均于2021年8月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉，武汉大学)；分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-14的保藏编号为CCTCCNO：C 2021207；分泌番茄褐色皱果病毒单抗杂交瘤细胞株FL447-16的保藏编号为CCTCCNO：C 2021208。

本发明的第二方面，提供单克隆抗体组合，所述单克隆抗体组合包括：单克隆抗体FL447-14和单克隆抗体FL447-16；所述单克隆抗体FL447-14由保藏编号为CCTCC NO：C2021207的杂交瘤细胞株分泌产生，所述单克隆抗体FL447-16由保藏编号为CCTCC NO：C2021208的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明的第三方面，提供上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体组合在制备检测番茄褐色皱果病毒的产品中的应用。