[发明专利]一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，其特征在于，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成；

所述人粒细胞集落刺激因子突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒pUC57-hG-CSF为模板，将突变后的序列命名为hG-CSF-Mut；

所述定点突变引物的序列如下：

SiteⅠ

Forward：5'-GAGTTTTCTGCTGAAATGCTGGGAACAGGTTCGTAAAATTC-3'；

Reverse：5'-GAATTTTACGAACCTGTTCCCAGCATTTCAGCAGAAAACTC-3'；

SiteⅡ

Forward：5'-GTAAAATTCAGGGTAGGGGCGCAGCCCTGCAG-3'；

Reverse：5'-CTGCAGGGCTGCGCCCCTACCCTGAATTTTAC-3'；

将突变后的hG-CSF-Mut序列与蓖麻毒素B链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hG-CSF-Mut/RTBD1序列，hG-CSF-Mut/RTBD1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hG-CSF-Mut/RTBD1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、人粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；

步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；

步骤三、重组hG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白表达；

步骤四、重组hG-CSF-Mut/RTBD1融合蛋白纯化与复性。

3.根据权利要求2所述的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤一具体包括以下步骤：

（1）通过SWISS-MODEL在线平台对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行同源建模；通过Z-DOCK方法对人粒细胞集落刺激因子分子和人粒细胞集落刺激因子受体分子进行对接，得到复合物结构模型；通过丙氨酸扫描对上述复合物结构模型全长序列进行突变，获得潜在的突变位点；通过虚拟饱和突变对单个突变位点计算突变前后的分子间结合力变化；

（2）重组质粒pUC57-hG-CSF的制备：

通过NCBI Genbank数据库查询人粒细胞集落刺激因子基因序列，将获取的序列进行全基因合成，合成过程中以大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后，克隆至大肠杆菌克隆载体pUC57中，获得大肠杆菌重组克隆载体pUC57- hG -CSF；

（3）设计定点突变引物，其序列如下：

SiteⅠ

Forward：5'-GAGTTTTCTGCTGAAATGCTGGGAACAGGTTCGTAAAATTC-3'；

Reverse：5'-GAATTTTACGAACCTGTTCCCAGCATTTCAGCAGAAAACTC-3'；

SiteⅡ

Forward：5'-GTAAAATTCAGGGTAGGGGCGCAGCCCTGCAG-3'；

Reverse：5'-CTGCAGGGCTGCGCCCCTACCCTGAATTTTAC-3'；

（4）以重组质粒pUC57-hG-CSF为模板，将突变后的序列命名为hG-CSF-Mut；将突变后的hG-CSF-Mut序列与蓖麻毒素B链截短肽序列通过柔性linker连接起来形成hG-CSF-Mut/RTBD1序列，hG-CSF-Mut/RTBD1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hG-CSF-Mut/RTBD1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并插入至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为pMD18T-hG-CSF-Mut/RTBD1质粒，作为hG-CSF突变表达载体。