[发明专利]一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物基因工程领域，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成，柔性linker为(Gly₄Ser)₃连接肽。本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白的制备方法包括：人粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；大肠杆菌重组表达载体构建；重组hG‑CSF‑Mut/RTBD1融合蛋白表达；重组hG‑CSF‑Mut/RTBD1融合蛋白纯化与复性。该重组融合蛋白半衰期长、生物学活性高，延长了半衰期，提高了生物活性，降低了粒细胞集落刺激因子制剂的生产成本，可应用于制备治疗白细胞减少症药物。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF-Mut/RTBD1)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。G-CSF临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。但是，粒细胞集落刺激因子在临床中存在半衰期短、体内易降解等难题，限制了粒细胞集落刺激因子的临床应用。

蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)由RTA和RTB两个肽链以二硫键共价连接。其中RTB由262个氨基酸组成。RTB单独存在时没有毒性。目前认为RTB主要有两个功能：1、帮助RTA转运至细胞质内，抑制蛋白质合成；2、RTB增强机体免疫反应。

目前，将人G-CSF突变体与蓖麻毒素B链截短肽组成重组融合蛋白来提高重组融合蛋白治疗白细胞减少症的活性及延长重组融合蛋白半衰期的研究还未见报道。

发明内容

本发明提供一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，以提高重组融合蛋白治疗白细胞减少症的活性，延长重组融合蛋白半衰期，提高白细胞减少症的治疗效果。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种人粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，该重组融合蛋白由人粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成。

作为优选的实施方式，所述人粒细胞集落刺激因子突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒pUC57-hG-CSF为模板，将人粒细胞集落刺激因子序列中第19位亮氨酸突变为色氨酸，第28位天冬氨酸突变为精氨酸，将突变后的序列命名为hG-CSF-Mut；

所述定点突变引物的序列如下：

SiteⅠ

Forward：5'-GAGTTTTCTGCTGAAATGCTGGGAACAGGTTCGTAAAATT C-3'；

Reverse：5'-GAATTTTACGAACCTGTTCCCAGCATTTCAGCAGAAAACTC-3'；

SiteⅡ

Forward：5'-GTAAAATTCAGGGTAGGGGCGCAGCCCTGCAG-3'；

Reverse：5'-CTGCAGGGCTGCGCCCCTACCCTGAATTTTAC-3'。