[发明专利]一种重组工程菌及其用于高效转化L-泛解酸内酯的应用

说明书

本发明涉及一种重组工程菌及其用于高效转化L‑泛解酸内酯的应用，所述重组工程菌经诱导后高效表达L‑泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶，高效转化L‑泛解酸内酯生成DL‑泛解酸内酯。本发明的重组工程菌显著提高DL‑泛解酸内酯的纯度和质量、反应效率和资源利用率，降低生产成本，具有操作简便、绿色环保等优点。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组工程菌及其用于高效转化L-泛解酸内酯的应用。

背景技术

D-泛解酸内酯为用于合成维生素类药D-泛醇及神经营养药D-高泛酸钙的医药中间体，并用作饲料添加剂和日化产品的合成前体，年产量超过上万吨。工业制备D-泛解酸内酯常采用化学法和拆分法相结合的方法，包括下述步骤：异丁醛和甲醛发生羟醛缩合生成羟基特戊醛，再和氰基反应生成氰醛，水解生成DL-泛解酸内酯外消旋体，采用化学拆分和酶拆分，制得D-泛解酸内酯。但拆分产生大量L-泛解酸内酯，如不合理利用将造成资源浪费，增加生产成本。

《化学酶法合成D-泛解酸内酯的研究进展》(汪钊等，发酵科技通讯，第45卷第4期)公开了DL-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯脱氢酶生成酮泛解酸内酯，再经酮泛解酸内酯还原酶还原得到D-泛解酸内酯，该方法中L-泛解酸内酯脱氢酶的脱氢效率低。还公开了L-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯脱氢酶反应得到酮泛解酸内酯，自发水解生成酮泛解酸，再经酮泛解酸还原酶还原得到D-泛解酸，酸性闭环，制得D-泛解酸内酯。该方法因L-泛解酸内酯脱氢酶的反应效率低下，且自发水解在实际实验中较难控制，基本未得到D-泛解酸内酯，实验难以重现。

CN110423717A公开了一种多酶重组细胞及多酶级联催化合成D-泛解酸内酯的方法，该方法使用L-泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶组成的三元复合酶转化生产D-泛解酸内酯。但葡萄糖脱氢酶易诱导生成反应副产物葡萄糖酸，导致D-泛解酸内酯的分离困难，且产生大量废料，增加处理困难。为此，需要开发高转化率的D-泛解酸内酯制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组载体，所述重组载体选自含有L-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的重组载体。

本发明的优选技术方案中，L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示分别在第一重组载体、第二重组载体、第三重组载体和第四重组载体上。

本发明的优选技术方案中，所述重组载体任选地包括第四重组载体或第五重组载体的任一种，其中，第四重组载体包含酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第五重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的优选技术方案中，所述重组载体选自第一重组载体包含L-泛解酸内酯脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第四重组载体包含酮泛解酸内酯还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和甲酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明优选的技术方案中，所述重组载体用于L-泛解酸内酯制备DL-泛解酸内酯。

本发明优选的技术方案中，所述第一重组载体包括L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因，优选所述L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因源自红串红球菌、红球菌、分支杆菌、诺卡氏菌、链霉菌、放线菌中的任一种。

本发明优选的技术方案中，所述L-泛解酸内酯脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到L-泛解酸内酯脱氢酶基因序列。