[发明专利]艾塞那肽变体及其聚乙二醇缀合物的制备方法

权利要求书

1.一种艾塞那肽变体Cys³⁹-Exendin-4的制备方法，其包括以下步骤：

采用三步反相柱色谱法纯化Cys³⁹-Exendin-4粗品，其中Cys³⁹-Exendin-4的结构为：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-NH₂，如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，

所述Cys³⁹-Exendin-4粗品通过固相合成方法得到。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，

所述三步反相柱色谱法中的第一步反相柱色谱法使用二元流动相体系，其中流动相A为酸性物质在水中的溶液，流动相B为酸性物质在有机溶剂中的溶液；流动相A和流动相B中的酸性物质各自独立地选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、磷酸、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的一种或多种；有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种；流动相A和流动相B中的酸性物质的体积百分比各自独立地为0.01％-1％；

所述第一步反相柱色谱法包括使用体积百分比为0％-95％的流动相B进行的梯度洗脱过程，梯度洗脱过程的时间为120min以内。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其中，

所述三步反相柱色谱法中的第二步反相柱色谱法使用二元流动相体系，其中流动相A为酸性物质在水中的溶液，流动相B为有机溶剂；流动相A中的酸性物质选自磷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种；流动相A的pH值为1.0-6.0；有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种；

所述第二步反相柱色谱法包括使用体积百分比为0％-85％的流动相B进行的梯度洗脱过程，梯度洗脱过程的时间为100min以内。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其中，

所述三步反相柱色谱法中的第三步反相柱色谱法使用二元流动相体系，其中流动相A为酸性物质在水中的溶液，流动相B为酸性物质在有机溶剂中的溶液；流动相A和流动相B中的酸性物质各自独立地选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、磷酸、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的一种或多种；有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或多种；流动相A和流动相B中的酸性物质的体积百分比各自独立地为0.005％-0.5％；

所述第三步反相柱色谱法包括使用体积百分比为0％-95％的流动相B进行的梯度洗脱过程，梯度洗脱过程的时间为100min以内。

6.一种聚乙二醇化艾塞那肽变体mPEG-ppMAL-Cys³⁹-Exendin-4的制备方法，其包括以下步骤：

先通过根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法得到Cys³⁹-Exendin-4，再将其与mPEG-ppMAL进行缀合并纯化。

7.一种聚乙二醇化艾塞那肽变体mPEG-ppMAL-Cys³⁹-Exendin-4的制备方法，其包括以下步骤：

先将纯化后的Cys³⁹-Exendin-4与mPEG-ppMAL进行缀合，再依次采用离子交换色谱法与三步反相柱色谱法纯化mPEG-ppMAL-Cys³⁹-Exendin-4粗品，其中mPEG-ppMAL-Cys³⁹-Exendin-4的结构为：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，

所述纯化后的Cys³⁹-Exendin-4通过根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法得到。