[发明专利]艾塞那肽变体及其聚乙二醇缀合物的制备方法

说明书

本发明属于蛋白质药物技术领域，涉及艾塞那肽变体及其聚乙二醇缀合物的制备方法。具体而言，Cys³⁹‑Exendin‑4的制备方法采用三步反相柱色谱法进行纯化，而mPEG‑ppMAL‑Cys³⁹‑Exendin‑4的制备方法先将纯化后的Cys³⁹‑Exendin‑4与mPEG‑ppMAL进行缀合，再依次采用离子交换色谱法与三步反相柱色谱法进行纯化。纯化多肽时，使用三步反相柱色谱法，并且优化第二步使用的酸性物质，使得产品的纯度和产量均有明显提高。纯化缀合物时，依次使用离子交换色谱法和三步反相柱色谱法，使得产品的纯度可达99.5％以上，并且产量较高。组合使用两种制备方法，能够满足工业化生产的需要。

技术领域

本发明属于蛋白质药物技术领域，涉及一种艾塞那肽变体的制备方法，还涉及一种聚乙二醇化艾塞那肽变体的制备方法。

背景技术

随着经济社会的发展、人口平均寿命的延长和生活方式的变化，糖尿病已经成为世界各国主要的卫生保健问题。无论在发达国家或是发展中国家，糖尿病的发病率都在急剧上升。糖尿病是由于胰腺分泌功能缺陷或胰岛素作用缺陷引起的，以血糖升高为特征的代谢性疾病。糖尿病患者若血糖长期控制不佳，可导致器官组织损伤，成为“万病之源”，伴发各种器官，尤其是眼、心、血管、肾、神经损害或器官功能不全或衰竭，严重可致患者残疾或者死亡。根据发病机制不同，糖尿病主要分为I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他类型糖尿病。II型糖尿病患者是糖尿病的主体，占比约为90％。II型糖尿病的特点是胰岛素分泌或作用失调及β-细胞功能障碍，致使脂肪、碳水化合物以及蛋白质代谢紊乱，造成慢性血糖过高，最终导致各种血管及脏器并发症的出现。

糖尿病是一种进展型疾病，当生活干预后，血糖控制无法达标时，需要进行药物干预治疗。自1920年人类使用动物胰岛素治疗糖尿病以来，在100年的时间里，全球共发现、发明了九大类主要的糖尿病治疗药物：双胍类、磺脲类、噻唑烷二酮类(TZDs)、格列奈类、α-糖苷酶抑制剂类、DPP-4抑制剂类、SGLT-2抑制剂类、胰岛素类、GLP-1类。其中，GLP-1于1985年被发现，其是在人体进食后由胰高血糖素原基因表达，并主要在肠道黏膜L细胞分泌的一种产物，它能刺激胰岛β-细胞分泌胰岛素，对稳定血糖水平有重要作用。但GLP-1在体内很容易被DPP4降解，半衰期不足2分钟，几乎不能成为有效的抗糖尿病药物。

艾塞那肽(exenatide，或称Exendin-4)是在爬行动物毒蜥的唾液分泌物中发现的多肽，与GLP-1(7-36)具有高度同源性(53％)。研究表明，Exendin-4同样可以与GLP-1受体结合，并在药理上表现出与GLP-1类似的激动作用，例如增加胰岛素的合成及葡萄糖依赖性促胰岛素分泌；刺激β-细胞增生和再生，抑制β-细胞凋亡，从而增加β-细胞的数量；抑制胰高血糖素的分泌；抑制肝糖生成，但不会引起严重低血糖；抑制餐后胃肠道动力及分泌功能；降低食欲，减少食物的摄入；对神经细胞具有保护作用。Exendin-4促进胰岛素分泌和抑制餐后胰高血糖素分泌的作用具有血糖依赖性，优于目前所用的磺酰脲类降糖药，不易发生低血糖反应，能够极大减少血糖监测次数，并能减轻体重。

聚合物修饰技术是上世纪70年代发展起来的一种强有力的修饰技术，其中尤以聚乙二醇化(PEGylation)技术为代表。该技术是将聚乙二醇(PEG)与蛋白质药物进行化学结合，对蛋白质的表面进行修饰。通过PEG的修饰，一方面增加了蛋白质的分子量，降低了其在肾脏的排泄速率；另一方面，偶联的PEG链在被修饰的蛋白质分子表面产生空间位阻效应，减低血液中蛋白水解酶对该蛋白的水解作用，从而有效地延长了其在循环系统内的滞留时间，导致药物血浆周期延长和系统性药物暴露增加并提高疗效。

相比于艾塞那肽或其变体，经特异性修饰而得到其聚乙二醇缀合物在作用持续时间、生物利用度及治疗效果等方面均具有明显优势。临床研究表明，聚乙二醇化艾塞那肽或其变体对于II型糖尿病患者具有优异的疗效和安全性。然而，目前尚无适合大规模生产的聚乙二醇化艾塞那肽或其变体的合成及纯化工艺。

发明内容