[发明专利]基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

在CNN3基因的第二外显子的两边分别插入FloxP基因片段得到供体DNA；

构建Cas9/gRNA靶点，其中，所述Cas9/gRNA靶点包括Cnn3-L1基因片段和Cnn3-R1基因片段；

将所述Cnn3-L1片段、所述Cnn3-R1片段及Cas9核酸内切酶分别进行体外转录以构建同源重组模板，得到对应mRNA和RNA；

将所述Cnn3-L1片段、所述Cnn3-R1片段及所述Cas9核酸内切酶分别对应的mRNA和RNA，与所述供体DNA一起显微注射到小鼠的受精卵中得到创始Cnn3-FloxP小鼠；

将所述创始Cnn3-FloxP小鼠与雌鼠进行交配后自交，得到稳定遗传的纯合子CNN3^fl/fl小鼠；

将所述纯合子CNN3^fl/fl小鼠与组织特异性表达的Cre小鼠交配得到Cre^+/-/CNN3^fl/wt小鼠并进行自交，通过基因鉴定以筛选出基因型Cre^+/-/CNN3^fl/fl小鼠。

2.根据权利要求1所述的基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Cnn3-L1基因片段的序列为CTTGCGTCATGCGTGACGGGG；所述Cnn3-R1基因片段的序列为AGGCACAAGCCCACAGACAGG。

3.根据权利要求1所述的基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述雌鼠为C57BL/6J雌鼠。

4.根据权利要求3所述的基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述创始Cnn3-FloxP小鼠到达6-8周龄时，与所述雌鼠进行交配，得到稳定遗传的杂合子CNN3^fl/wt小鼠，所述杂合子CNN3^fl/wt小鼠自交得到稳定遗传的纯合子CNN3^fl/fl小鼠。

5.根据权利要求1所述的基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述通过基因鉴定以筛选出基因型Cre^+/-/CNN3^fl/fl小鼠之后，还包括：

采用Western blot检测所述Cre^+/-/CNN3^fl/fl小鼠CNN3基因所编码蛋白Calponin-3表达变化，以验证所述Cre^+/-/CNN3^fl/fl小鼠是否为CNN3基因敲除的小鼠。