[发明专利]基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法

说明书

本发明公开了基于Cre‑FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法，方法包括：在CNN3基因的第二外显子的两边分别插入FloxP基因片段，构建Cas9/gRNA靶点并构建同源重组模板，将同源重组模板与所述供体DNA一起显微注射到小鼠的受精卵中得到创始Cnn3‑FloxP小鼠，并与雌鼠进行交配后自交，得到稳定遗传的纯合子CNN3^fl/fl小鼠；将所述纯合子CNN3^fl/fl小鼠与组织特异性表达的Cre小鼠交配后进行自交，经基因鉴定筛选出基因型为Cre^+/‑/CNN3^fl/fl小鼠。本发明设计基因技术领域，可高效构建得到特异性组织或特异性细胞CNN3基因敲除的小鼠，大幅提高了选择性敲除CNN3小鼠模型的构建效率及构建成功率。

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术

Calponin蛋白是钙/钙调蛋白和肌动蛋白的结合蛋白，有3个亚型：calponin-1(basic calponin)、calponin-2(neutralcalponin)和calponin-3(acid calponin)。calponin-3作为calponin家族中唯一在中枢神经系统分布的亚型，且主要集中在脑内星形胶质细胞和神经元。

calponin-3蛋白的调控基因CNN3，定位在染色体1p21-22。最初发现CNN3在胚胎发育中调节神经管的形态发生。由于中枢神经系统发育的缺陷，小鼠中CNN3的系统性敲除导致胚胎和新生儿死亡。随后的研究提供了CNN3超越神经生长发育领域功能的证据。Calponin 3(CNN3)是一种F-肌动蛋白结合蛋白，可调节肌动蛋白的细胞骨架重排，在滋养层细胞和成肌细胞的细胞融合、真皮成纤维细胞的细胞运动和收缩过程中，CNN3通过参与应力纤维形成或细胞骨架重塑在细胞分化、增殖和迁移中发挥作用。

在CNN3参与癌症发生发展研究中发现，CNN3与结直肠癌淋巴结转移和腹膜转移有关，且参与结肠癌的淋巴结转移和化疗耐药性反应。在胃癌研究中，与低侵袭性或非侵袭性癌细胞系相比，CNN3表达在高侵袭性癌细胞系中显着升高，CNN3蛋白的消耗抑制了胃癌细胞的侵袭能力；高侵袭性MKN-28胃癌细胞比无侵害性MKN-45细胞对阿霉素的耐药性更高，MKN-28细胞中CNN3表达的敲低使它们对阿霉素治疗重新敏感，CNN3在胃癌细胞的侵袭性和阿霉素抗性中起关键作用。最新研究表明，CNN3可以通过影响RPLP1 mRNA表达成为致癌基因，作为阻断宫颈癌转移的潜在靶标。

对耐药性癫痫患者颞叶组织进行基因芯片扫描，不仅发现CNN3基因显著上调，而且发现calponin-3蛋白在患者脑组织神经元及星形胶质细胞内均表达异常。采用立体定位注射方法将开发构建的CNN3基因沉默/过表达的慢病毒载体注入实验鼠局部脑区，发现calponin-3影响实验鼠的癫痫易感性，但具体作用环节不清。在系统敲除CNN3可出现胚胎致死的背景下，为了深入研究CNN3在多学科多领域研究中的作用机制，亟需构建选择性敲除CNN3小鼠模型。而现有技术方法存在难以高效构建选择性敲除CNN3小鼠模型的问题。

发明内容

本发明实施例提供了一种基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法，旨在解决现有技术方法中所存在的构建选择性敲除CNN3小鼠模型的效率不高的问题。

本发明实施例提供了一种基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法，其包括：

在CNN3基因的第二外显子的两边分别插入FloxP基因片段得到供体DNA；

构建Cas9/gRNA靶点，其中，所述Cas9/gRNA靶点包括Cnn3-L1基因片段和Cnn3-R1基因片段；

将所述Cnn3-L1片段、所述Cnn3-R1片段及Cas9核酸内切酶分别进行体外转录以构建同源重组模板，得到对应mRNA和RNA；