[发明专利]重组人源胶原蛋白及其人造角膜

说明书

本发明提供了一种重组人源胶原蛋白及其人造眼角膜。另外，本发明还提供了该人造眼角膜的制备方法及其应用等。

技术领域

本发明属于生物医药与生物材料技术领域，更具体地，本发明涉及重组人源胶原蛋白及其人造眼角膜。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的一类结构蛋白质。胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使结缔组织具有机械强度，同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有良好的生物相容性与可生物降解的特性。基于这些特性，胶原蛋白在烧创伤修复、眼角膜疾病治疗、创面止血、药物传递与缓释、矫形、保健、美容等医疗卫生领域有广泛应有。常见的胶原蛋白是从牛骨、牛皮、鱼鳞、鱼皮、猪皮等动物组织中分离提取而来，存在动物病毒隐患、应用于人体时会产生异体或异种的排异反应且分子量不确定、分布范围广等缺点和不足。本发明人的前期研究成果很好的克服了这些缺陷：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。该重组胶原是以III型胶原为模板，体外构建六串联序列并连入pPIC9K形成类人胶原蛋白基因六串联体表达载体pPIC9KG6。将该表达载体导入毕赤酵母后进行高密度发酵，并通过分离纯化，得到高纯度重组Ⅲ型人源胶原蛋白RHC，作为本发明的首选原料。

目前全球每年有超过400,000例角膜致盲病例，原因是外伤或感染造成的角膜疤痕，这类病例可通过手术植入的生物工程角膜进行治疗。治疗方法包括人供体角膜移植或使用从转基因猪身上采集的角膜组织。然而，人供体角膜严重短缺，猪角膜存在光学透明度和耐久性不足的问题，这两种方法都需要额外的免疫抑制药物来防止移植排斥。人III型胶原是一种存在于正常人角膜中的关键结构蛋白。利用人III型胶原制成的生物合成角膜光学透明，可替代上述治疗方法，并无需使用免疫抑制药物。

壳聚糖，也称几丁质，是甲壳素的去乙酰化产物，甲壳素是节肢动物和真菌中最主要的结构生物高分子。它存在于甲壳类动物、真菌和酵母的细胞壁以及昆虫的外骨骼中。壳聚糖主要由螃蟹、虾或其他海洋甲壳类动物的壳中提取。壳聚糖拥有良好的生物相容性、降解速率以及一定的抗菌和创伤愈合作用，此外壳聚糖还被证明有优良的凝血性能和组织修复功能，因此壳聚糖被广泛地应用于止血、创伤敷料、骨修复和神经修复等领域。其中，壳聚糖的羧甲基产物(CMCS)具备良好的水溶性，在制备过程中可以不涉及有机酸溶剂，因此作为本发明的首选原料。

水凝胶作为一种不溶于水但有很强亲水性的柔性高分子材料，其分子具有独特的三维立体网络状构型并保持一定的形状。水凝胶作为一类高保水、生物相容性佳的仿生生物功能材料，长期以来一直用于组织工程支架材料的开发。而眼角膜属于软组织，同时大量含水，胶原基水凝胶的特性与角膜ECM高度相似，并具有较高的生物相容性，因此胶原基水凝胶是一种作为角膜替换、角膜修复、软性角膜接触镜(隐形眼镜)、硬性角膜接触镜(隐形眼镜)、角膜细胞体外培养及眼部缓释药物载体的优选生物材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供新的重组胶原蛋白和新的角膜。另外，本发明还提供它们的制备方法和应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了重组人源胶原蛋白，其氨基酸序列

a)如序列表中的SEQ ID NO：1所示；或

b)是对序列表中的SEQ ID NO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。

在第二方面，本发明提供了核酸分子，其编码本发明第一方面的重组人源胶原蛋白。

在第三方面，本发明提供了载体，其含有本发明第二方面的核酸分子。载体优选是表达载体，更优选是酵母表达载体。

在第四方面，本发明提供了宿主细胞，其含有本发明第二方面的核酸分子。宿主细胞，其含有本发明第二方面的核酸分子。宿主细胞可以通过转染或转导本发明第三方面的载体来制备。宿主细胞优选是酵母细胞。