[发明专利]一种用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合、试剂盒及鉴别方法

说明书

本发明公开了一种用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合、试剂盒及鉴别方法，属于分子生物学技术领域。本发明用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合包括：(a)SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:3所示的第一引物探针组合；(b)SEQ ID NO:4‑SEQ ID NO:6所示的第二引物探针组合；(c)SEQ ID NO:7‑SEQ ID NO:9所示的第三引物探针组合；和(d)SEQ ID NO:10‑SEQ ID NO:12所示的第四引物探针组合。所述试剂盒和鉴定方法能够同时鉴别非洲猪瘟野毒株与疫苗毒株的四个基因，不同基因的引物之间互相无干扰，并且具有灵敏性高、特异性强、重复性和稳定性好的特点。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、发热、高度接触传染性疾病。家猪与野猪普遍易感，软蜱为ASFV的贮藏宿主和媒介。ASFV的潜伏期为5-15天，一旦爆发病程短，病死率高，可达100％。临场症状复杂且难以与其他疾病进行区分，多表现为高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。然而，非洲猪瘟发病后并没有有效的治疗措施，且该病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，也没有有效的疫苗防疫。

ASFV是一种直径约为170-200nm的正20面体病毒，由内部的双链DNA和外周的衣壳及囊膜组成，大小约170～190kb。ASFV基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区，ASFV基因组大小变化由可变区决定。

目前国内的主流疫苗由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高等利用分离到的黑龙江非洲猪瘟流行毒株(Pig/CN/HLJ/2018)为亲本，构建了MGF360-505R基因缺失和CD2V(EP402R)与MGF360-505R双基因联合缺失的减毒活疫苗，分别命名为rASFVΔ360-eGFP、rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry。另外张艳艳等以我国首例非洲猪瘟疫情中分离的流行毒株(SY18)为亲本株，构建了MGF基因和CD2V(EP402R)基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株，主要缺失的毒力基因有多基因家族MGF360-505(MGF360-9L、MGF360-10L、MGF360-11L、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、505-1R、505-2R、505-3R)和EP402R，随着今后疫苗的上市，可能出现阴性场感染疫苗毒的情况，由于非洲猪瘟野毒感染与疫苗毒感染，对于猪场的疫病防控措施及拔牙的方法都有极大的区别，因此建立一种快速、灵敏、准确的鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗毒株的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合、试剂盒及鉴别方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合，包括：用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因、非洲猪瘟病毒EP402R基因、非洲猪瘟病毒MGF360-14L基因、非洲猪瘟病毒疫苗毒株特有EGFP荧光报告基因的引物探针组合；

所述用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因的引物探针组合，其核苷酸序列如下：

上游引物B646L-F：如SEQ ID NO:1所示

下游引物B646L-R：如SEQ ID NO:2所示

荧光探针B646L-P：如SEQ ID NO:3所示；

所述用于检测非洲猪瘟病毒EP402R基因的引物探针组合，其核苷酸序列如下：