[发明专利]基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒

权利要求书

1.一种基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、设计非标记探针、上游引物和生物素标记下游引物；

根据人CYP2D6基因以及CYP2D8P基因的序列特点，设计非标记探针、上游引物和生物素标记下游引物；

步骤2、获取待测样本的基因组DNA；

步骤3、配制反应体系；

在同一反应体系中加入待测样本的基因组DNA、上游引物、生物素标记下游引物、DNA聚合酶，dNTPs脱氧核糖核苷三磷酸以及PCR Buffer；

步骤4、进行PCR反应；

将配制好的反应体系置于PCR仪进行PCR反应，实现基因扩增；

步骤5、获取单链PCR产物；

吸附带有生物素标记的双链PCR产物，并通过诱导DNA变性，分离得到带有生物素标记的单链PCR产物；

步骤6、分析熔解曲线并判定CYP2D6基因的拷贝数；

将单链PCR产物、非标记探针和双链荧光染料混合孵育，进行溶解反应，绘制溶解曲线，进行熔解曲线分析；

根据熔解曲线中CYP2D6基因和CYP2D8P基因产物熔解峰的荧光强度比值，判定待测样本CYP2D6基因的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于：

步骤1中的生物素标记下游引物、上游引物及非标记探针如下：

5’-生物素标记下游引物(18nt)：

5’-生物素-CCTGTACCCTTCCTCCCT-3’

上游引物(18nt)：

5’-TGGTGGCTGACCTGTTCT-3’

非标记探针(20nt)：

5’-TGATCCTACATCCGGATGTG-spacer-3’。

3.根据权利要求2所述的基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于：所述非标记探针中的spacer选自C3 spacer、C6 spacer、Spacer9、Spacer18或PCsapcer中的一种。

4.根据权利要求1-3任一所述的基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于：步骤6根据下式判定待测样本CYP2D6基因的拷贝数：

CYP2D8P熔解峰荧光值/CYP2D6熔解峰荧光值＝K·(CYP2D8P拷贝数/CYP2D6拷贝数)，其中K是一个常数。

5.根据权利要求4所述的基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于：

若待测样本的CYP2D8P熔解峰荧光值/CYP2D6熔解峰荧光值在1.31～1.51之间，则该待测样本的CYP2D6基因拷贝数为1；

若待测样本的CYP2D8P熔解峰荧光值/CYP2D6熔解峰荧光值在0.91～1.20之间，则该待测样本的CYP2D6基因拷贝数为2；

若待测样本CYP2D6熔解峰缺失，仅存在CYP2D8P熔解峰，则该待测样本的CYP2D6基因拷贝数为0。

6.根据权利要求4所述的基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于：步骤5中利用链霉亲和素标记的磁珠吸附带有生物素标记的双链PCR产物。

7.根据权利要求6所述的基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于，步骤3中以单管反应体系20μL计，各个加入物的用量如下：

上游引物：250～500nM；生物素标记下游引物：250～500nM；DNA聚合酶：0.5～1U；四种dNTPs，各100～250μM；10×PCR Buffer：2.0μL；基因组DNA：1-50ng，去离子水补足体积20μL。

8.根据权利要求7所述的基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特征在于：步骤4中PCR反应参数设置如下：94～95℃，1～10min，不循环；94～95℃，5～20sec；60～62℃，20～30sec，共计31～33个循环。