[发明专利]基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测CYP2D6基因拷贝数的方法，尤其涉及一种基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒。克服传统检测基因拷贝数方法存在的成本高、周期长及普适性低等缺陷。方法包括以下步骤：(1)非标记探针、生物素标记下游引物和上游引物的设计及合成；(2)获取待测样本的基因组DNA；(3)配制PCR反应体系；(4)进行PCR反应；(5)利用链霉亲和素标记的磁珠获取单链PCR产物；(6)熔解曲线分析及CYP2D6基因拷贝数判定。本发明在不需要荧光探针的前提下，即可完成CYP2D6基因拷贝数分析。

技术领域

本发明涉及一种检测CYP2D6基因拷贝数的方法，尤其涉及一种基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒。

背景技术

人CYP2D6基因编码的产物是一种I相药物代谢酶，参与约30％临床药物的代谢。CYP2D6基因存在广泛的基因多态性和拷贝数变异，其中拷贝数变异会造成该酶活性的显著改变。通过分析CYP2D6基因的拷贝数和多态性，可实现该酶活性的快速检测。

传统检测基因拷贝数的方法多种多样，包括TaqMan荧光探针技术、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)和新一代测序技术等。尽管这些技术应用广泛，但其缺陷依旧明显：TaqMan荧光探针合成原料成本高、获取难度大，且通常无法克服信噪比低的缺陷，实验数据可重复性差。MLPA技术操作复杂，且需要毛细管电泳进行产物分析，整个实验耗时过长。新一代测序技术适合大样本的检测，但其依托的测序平台价格昂贵，且需要专业实验操作和数据分析人员，不适宜在普通实验室、基层医院或医学检验所开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒，以克服传统检测基因拷贝数方法存在的上述缺陷。

非标记探针是一种不携带任何荧光基团的寡核苷酸探针，且其3’末端核苷酸的-OH被封闭，能和互补的模板链杂交，但不能作为引物。

双链荧光染料是一类可与DNA双链结合的小分子，以SYBR green为代表。双链荧光染料在游离状态下无法被激发出荧光，但结合于DNA双链的小沟后，可被激发出特定波长的荧光。

当非标记探针与模板链杂交后，双链荧光染料结合与二者形成的双链小沟位置，此时可收集到特定波长的荧光信号。若此时缓慢升高体系温度，探针与模板形成的双链解链，荧光染料重新游离，可得到荧光强度随温度升高而降低的线性关系。将荧光强度对温度变化时间求导数便得到熔解曲线，熔解曲线的峰值为荧光信号降低速率最大时对应的温度，即为探针与模板的结合强度(退火温度)。由于模板序列的差别，同一条探针与不同模板的结合强度有细微的差别，表现在熔解峰的不同。传统的熔解曲线法常用于目标产物的鉴定和单核苷酸多态性分析。

而本发明根据前期研究，发现通过反向利用“竞争性扩增”的原理，可将CYP2D6基因的同源基因CYP2D8P作为其拷贝数定量的参照物，且两基因拷贝数的比值可通过探针熔解产生的熔解峰的比值换算而来。

本发明的技术方案是：

一种基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

步骤1、设计非标记探针、生物素标记下游引物和上游引物；

根据人CYP2D6基因以及CYP2D8P基因的序列特点，设计非标记探针、上游引物和生物素标记下游引物；其中CYP2D8P基因是与CYP2D6基因序列高度相似的假基因，拷贝数极其稳定，人体细胞中均有两个拷贝。

步骤2、获取待测样本的基因组DNA；

步骤3、配制反应体系；