[发明专利]一种G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白及其应用

权利要求书

1.一种G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，其特征在于，所述的G11-scFv-Nluc融合蛋白通过下述方法制备的：

以纳米荧光素酶Nluc作为生物发光的催化剂，将G11-scFv与纳米荧光素酶融合并克隆到pET22b表达载体中，获得的；

具体为：

分别以SNF1，SNR1以及SNF2，SNR2为引物分别克隆G11-scFv以及Nluc基因；

所述的SNF1引物的DNA序列为：CCGAATTCGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG；

所述的SNR1引物的DNA序列为：ACCGCCGCTGCCGCCACCACCCTGGCCGGCCTGG；

所述的SNF2引物的DNA序列为：GGTGGTGGCAGCGGCGGTATGGTCTTCACACTCGAA；

所述的SNR2的引物DNA序列为：CCGCTCGAGCGCCAGAATGCGTTCGCA；

分别以第一轮产物G11-scFv以及Nluc基因为模板，以SNF1，SNR2为引物进行重叠延伸PCR技术获得G11-scFv-Nluc；

所述的G11-scFv基因序列如SEQIDNO.1所示；Nluc基因序列如SEQIDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，其特征在于，所述的G11-scFv-Nluc融合蛋白通过下述方法制备的：

（1）G11-scFv-Nluc表达载体的构建：通过PCR技术克隆G11-scFv以及Nluc基因并拼接得到融合基因G11-scFv-Nluc，再经过双酶切、基因回收、酶连接获得表达载体pET22b(+)-G11-scFv-Nluc；

（2）G11-scFv-Nluc融合蛋白制备：通过化学转化法将表达载体转化到感受态细胞BL21，再培养阳性单克隆细菌，诱导剂诱导表达融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，其特征在于，步骤（1）所述G11-scFv-Nluc表达载体的构建具体按照以下步骤：

分别以SNF1，SNR1以及SNF2，SNR2为引物分别克隆G11-scFv以及Nluc基因；

所述的SNF1引物的DNA序列为：CCGAATTCGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG；

所述的SNR1引物的DNA序列为：ACCGCCGCTGCCGCCACCACCCTGGCCGGCCTGG；

分别以第一轮产物G11-scFv以及Nluc基因为模板，以SNF1，SNR2为引物进行重叠延伸PCR技术获得G11-scFv-Nluc；

所述的SNF2引物的DNA序列为：GGTGGTGGCAGCGGCGGTATGGTCTTCACACTCGAA；

所述的SNR2的引物DNA序列为：CCGCTCGAGCGCCAGAATGCGTTCGCA；

以第二轮PCR将pET22b载体与G11scFv-Nluc基因分别进行XholⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切产物经切胶回收后，再次进行酶连接获得表达载体pET22b(+)-G11-scFv-Nluc。

4.根据权利要求2所述的G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，其特征在于，步骤（2）所述G11-scFv-Nluc融合蛋白制备具体按照以下步骤：

基于步骤（1）所述的表达载体pET22b(+)-G11-scFv-Nluc，将表达载体全部转入100uLBL2感受态细胞中，冰浴25min，42℃水浴热休克90s，然后迅速将其放入冰盒2min；加入700uLLB培养基，37℃振荡1小时，吸取适量体积均匀涂布到含有抗生素的固体培养基中培养过夜；次日，挑取单克隆细菌进行培养，并送样进行测序，测序引物为T7，对测序准确阳性单克隆细菌进行扩大培养，并加入IPTG诱导剂进行诱导表达，使用B-per细菌裂解液提取蛋白并通过镍亲和层析柱纯化目的蛋白，并通过超滤对蛋白进行浓缩，最后采用SDS-PAGE电泳测定蛋白分子量和纯度。

5.权利要求1所述的G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白在制备尿液中甘胆酸检测抗体的应用。

6.一种检测甘胆酸生物发光免疫试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，GCA-OVA、甘胆酸。