[发明专利]一种G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种G11‑scFv‑Nluc双功能活性的融合蛋白及其应用，旨在提供一种具有较好特异性和信号放大作用融合蛋白，采用该融合蛋白建立超敏的生物发光免疫分析试剂盒，用于检测尿液中甘胆酸的含量，具有良好的应用价值及前景；所述的G11‑scFv‑Nluc融合蛋白通过下述方法制备的：以纳米荧光素酶作为生物发光的催化剂，将抗甘胆酸单链抗体(G11‑scFv)与纳米荧光素酶融合并克隆到pET22b表达载体中，获得的属于免疫检测技术领域。

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种融合蛋白，特别涉及一种G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，本发明还涉及G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白的应用。

背景技术

甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，是胆固醇在肝细胞内代谢的产物，其含量的测定对肝病诊断具较敏感性，是评价肝脏功能的一项很重要的指标。甘胆酸作为生物标志物提示甘胆疾病，该小分子的免疫分析检测为肝脏疾病的诊断、治疗和预后分析提供重要依据。相关研究指出，胆汁酸经肾脏排泄很明显，并与肝胆疾病程度相关，因此检测尿液中的甘胆酸对临床有一定指导价值。临床上检测甘胆酸多取静脉血，而针对一些小儿患者、不便于取静脉血的患者，检测其尿液中的甘胆酸有着其便利性与对疾病诊断的指导意义。

免疫分析方法中，增强灵敏度是一个不断的追求。在免疫分析方法中，增强灵敏度是一个不变的追求。为了提高检验方法的灵敏度，传统的ELISA通常与生物素和亲霉素、荧光、化学发光等修饰方法相结合。其中，荧光素酶标记技术是一种新型生物反应放大系统，并能与ELISA有机结合。由于荧光素酶具有高灵敏性与特异性，操作简单，反应迅速等有优势，目前被应用于快速检测等科学研究。然而，传统的荧光素酶在使用过程中还有不足之处，如荧光强度易受PH、离子强度、温度等因素影响、依赖ATP等，妨碍了其更多的用途。近年来，一种新型纳米荧光素酶的出现很好地弥补了传统荧光素酶身上的缺点。

为了提高检测方法的稳定与可操作性，本专利开发一种基于纳米荧光素酶的免疫分析方法，纳米荧光素酶分子量小、不需要ATP、发光效率高、在各个PH、温度下理化性质均比较稳定等优点，可以作为广泛地用于免疫分析方法。

发明内容

为了克服现有技术中的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种G11-scFv-Nluc融合蛋白，该融合蛋白具有较好特异性和信号放大作用。

本发明另一目的在于提供上述G11-scFv-Nluc融合蛋白用于检测尿液中甘胆酸的含量的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供技术方案是这样的：

一种G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，所述的G11-scFv-Nluc融合蛋白通过下述方法制备的：

以纳米荧光素酶作为生物发光的催化剂，将抗甘胆酸单链抗体(G11-scFv)与纳米荧光素酶融合并克隆到pET22b表达载体中，获得的。

进一步的，上述的G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，所述的G11-scFv-Nluc融合蛋白通过下述方法制备的：

(1)G11-scFv-Nluc表达载体的构建：通过PCR技术克隆G11-scFv以及Nluc基因并拼接得到融合基因G11-scFv-Nluc，再经过双酶切、基因回收、酶连接获得表达载体pET22b(+)-G11-scFv-Nluc；

(2)G11-scFv-Nluc融合蛋白制备：通过化学转化法将表达载体转化到感受态细胞BL21，再培养阳性单克隆细菌，诱导剂诱导表达融合蛋白。

进一步的，上述的G11-scFv-Nluc双功能活性的融合蛋白，步骤(1)所述G11-scFv-Nluc表达载体的构建具体按照以下步骤：

分别以SNF1，SNR1以及SNF2，SNR2为引物分别克隆G11-scFv以及Nluc基因；