[发明专利]一种单碱基编辑工具TaC9-ABE及其应用

说明书

本发明提供了一种单碱基编辑工具TaC9‑ABE及其应用。所述单碱基编辑工具TaC9‑ABE包括：表达TALE识别蛋白、野生型腺苷脱氨酶和突变型腺苷脱氨酶的第一载体；表达SgRNA和nSpCas9蛋白的第二载体。所述单碱基编辑工具TaC9‑ABE是一种双组份基因编辑器，具有高效、安全的特点。相比于传统的ABE7.10系统，该双组份编辑器TaC9‑ABE的编辑效率与其相似甚至更高。该双组份编辑器中的单组分在靶向位点完全没有编辑活性，且双组份同时转染时预测的脱靶区域也没有发现编辑现象，说明该双组份编辑器增加了靶向位点的识别特异性，减少了Cas9非特异性结合导致的DNA脱靶问题。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种单碱基编辑工具TaC9-ABE及其应用。

背景技术

靶向人类基因组的核苷酸编辑在科学研究和临床治疗中具有很高的应用价值。目前，应用最广泛的基因编辑方法是CRISPR/Cas9技术，它可以在包括哺乳动物等在内的多种生物细胞中进行基因组编辑，但由于产生双链断裂(DSB)会通过易错的非同源末端连接(NHEJ)引起随机插入缺失，同时目标的同源性定向修复(HDR)在靶位点效率较低，因此在临床应用方面CRISPR/Cas9技术存在一定的问题。

同时，随着人类基因组计划的开展，通过大数据分析已经证实与疾病相关的基因变异约80％属于点突变，而转换突变(从一个嘌呤-嘧啶碱基对变成另一嘌呤-嘧啶碱基对)约占已知致病性点突变的60％。

研究证明与催化受损的Cas9蛋白融合的胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶可高效实现靶向C-to-T(BE3)或A-to-G(ABE7.10)单碱基转换，不产生DSB且不依赖模板供体DNA。这种转换通过CRISPR/Cas9碱基编辑器，RNA引导的Cas蛋白与单链DNA(ssDNA)脱氨酶融合来实现。DNA中的A-T到G-C转换需要将腺苷脱氨为肌苷，而肌苷被细胞机制识别为鸟苷。在DNA没有脱氨基酶的情况下，大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶(TadA)与Cas9融合，并进化成ABE7.10，它能催化脱氧腺苷的靶向脱氨。ABE7.10编码两个TadA的副本，一个N端野生型(WT)TadA连接到进化的TadA(TadA*)，它的C端连接到一个“缺口酶”(即切割双链DNA(dsDNA)的一条链)版本的嗜热链球菌Cas9(nSpCas9)。

ABE对研究和校正致病等位基因特别有用，因为原则上将A-T碱基对转换为G-C碱基可纠正近一半的致病点突变，因此，单碱基编辑技术被人们寄予了厚望，相继成为脊髓性肌营养不良、地中海贫血、血友病等罕见病基因治疗的热门工具之一。

然而，随着研究的深入进行，研究人员发现单碱基编辑工具的脱靶效应明显。2019年3月通过全基因组测序分析，研究人员分别在小鼠和水稻上证实，除了传统的Cas9非特异性结合导致的DNA脱靶风险之外，CBE系统还存在Cas9非依赖型的DNA脱靶风险，而ABE系统的Cas9非依赖型的DNA脱靶效应相对较低。

2019年4月，J.Keith Joung团队的研究论文显示：CBE和ABE单碱基编辑不仅会导致DNA突变，还会导致大量RNA编辑。(参见Grünewald J,Zhou R,Garcia SP,Iyer S,LareauCA,Aryee MJ,Joung JK.Transcriptome-wide off-target RNA editing induced byCRISPR-guided DNA base editors.Nature.May；569(7756):433-437(2019).)。