[发明专利]一种染色方法、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种染色方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）液基薄层细胞制片：使用液基薄层细胞制片方法制备细胞涂片；

2）固定：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加固定剂室温固定；所述固定剂由95%乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：（0.01-0.03）；

3）细胞通透：清洗液冲洗细胞涂片，采用通透剂处理细胞涂片；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2%-0.4%胃酶溶液；

4）免疫细胞化学染色：采用P16^INK4a抗体对通透处理后的细胞涂片进行免疫细胞化学染色；

5）巴氏染色：对步骤4）已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片先采用橘黄G染色液染色，漂洗后采用EA50染色液染色；

6）脱水、透明、封片；

步骤1）中采用宫颈脱落细胞样本进行液基薄层细胞制片；

步骤3）中采用通透剂处理细胞涂片包括如下步骤：先在样本区域滴加通透剂Ⅰ并孵育，清洗液冲洗，再在样本区域滴加通透剂Ⅱ并孵育，或先在样本区域滴加通透剂Ⅱ并孵育，清洗液冲洗，再在样本区域滴加通透剂Ⅰ并孵育。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，固定的时间为5min。

3.根据权利要求1~2中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4）中免疫细胞化学染色包括如下步骤：

① 加过氧化物酶封闭剂：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加内源性过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min；

② 一抗孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加P16^INK4a抗体，于37℃孵育60min；

③ 一抗后孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；

④ 二抗孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min；

⑤ 显色：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加DAB显色液，室温孵育3-8min；

⑥ 苏木素复染：纯水冲洗细胞涂片，在样本区域滴加苏木素复染。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中巴氏染色包括如下步骤：将已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片置于95%乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于巴氏染色液橘黄G染色液中1min，95%乙醇中漂洗2次，每次10s，然后置于EA50染色液中2.5min，95%乙醇中漂洗2次，每次10 s。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤5）之前还包括如下步骤：对步骤4）已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片进行脱水透明并用中性树胶封片，而后进行褪片脱胶。

6.一种用于实施权利要求1所述染色方法的辅助宫颈鳞状上皮细胞染色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固定剂和通透剂，所述固定剂由95%乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：（0.01-0.03）；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2%-0.4%胃酶溶液。

7.一种用于实施权利要求1所述染色方法的宫颈鳞状上皮细胞染色试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固定剂、通透剂、过氧化物酶封闭剂、P16^INK4a抗体、酶标羊抗鼠/兔聚合物、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液、橘黄G染色液和EA50染色液；其中，所述固定剂由95%乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95%乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：（0.01-0.03）；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25%-0.5%胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2-0.4%胃酶溶液。

8.如权利要求6或7所述的试剂盒在P16^INK4a免疫细胞化学染色与巴氏染色联合染色方面的应用。