[发明专利]附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法

权利要求书

1.附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)选取人体健康正常的附着点软组织及周围骨组织的部分，使用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水清洗后，在无菌条件下将附着点软组织和周围骨分离，将附着点软组织切碎并称重，将周围骨组织咬碎并称重；

2)将步骤1)得到的附着点软组织和周围骨组织分别转移至试管中，将附着点软组织进行酶消化处理，周围骨组织进行酶消化处理或机械分离处理；

3)采用70毫米无菌过滤器对步骤2)所得的软组织处理液或周围骨组织处理液进行过滤，将滤液离心、弃去上清后，加入培养基重悬细胞；

4)另取一个试管，吸取步骤3)所得的细胞悬液，缓慢置于淋巴细胞分离液上层，然后进行离心，离心后将中间棕黄色的淋巴细胞层转出，并加入磷酸盐缓冲溶液稀释；

5)将经步骤4)处理后的样品进行离心，弃上清，采用培养基重悬细胞，得到细胞悬液；

6)从步骤5)所得的细胞悬液中分选出所需细胞，将分选出来的细胞接种于微孔板，再加入相应的细胞培养基培养，获得免疫细胞体外模型。

2.根据权利要求1所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：在所述步骤1)中采用咬骨钳将周围骨组织咬碎至5mm²，附着点软组织切碎至1-2mm²。

3.根据权利要求1所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中酶消化处理的具体方法为：向试管中加入消化溶液，再将试管放入水浴震荡器中，在36-37℃的条件下持续轻度震荡3.4-3.6h，完成震荡后加入样品溶液体积的2-3倍的磷酸盐缓冲溶液；所述机械分离处理的具体方法为：向试管内加入培养基，并将试管放入涡旋振荡器中涡旋震荡。

4.根据权利要求3所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：所述消化溶液包括浓度为600U/ml的胶原酶、体积含量为20％胎牛血清、和体积含量为80％磷酸盐缓冲溶液，加入的消化溶液的体积为以克为单位的样品重量的5倍。

5.根据权利要求1所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤5)中所用培养基为：Dulbecco改良Eagle培养基、RPMI-1640培养基、DMEM培养基或MEM培养基中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：所述步骤3)的离心条件为400-500g离心5-10min。

7.根据权利要求1所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：所述步骤4)的离心条件为800-1000g离心20-30min，无加减速。

8.根据权利要求1所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中细胞悬液与淋巴细胞分离液的体积比为1.3-2:1，淋巴细胞层与磷酸盐缓冲溶液的体积比为1:2-3。

9.根据权利要求1所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：所述步骤5)的离心条件为400-500g离心5-10min。

10.根据权利要求1所述的附着点组织处免疫细胞体外模型的构建方法，其特征在于：所述步骤6)中采用流式细胞仪或磁珠分选法对细胞进行分选。